LncRNA Gas5作为脑内无义介导的降解（NMD）通路的靶标，在Tau蛋白病小鼠模型中调节神经炎症和神经退行性疾病通路

《International Journal of Molecular Sciences》：LncRNA Gas5, a Target of the Nonsense-Mediated Decay Pathway in the Brain, Regulates Neuroinflammation and Neurodegenerative Disease Pathways in a Tauopathy Mouse Model

　　

在Tau蛋白病中，脑内无义介导的降解（NMD）靶基因的失调仍鲜为人知。表达人源突变型P301S tau的PS19转基因小鼠被用于评估NMD靶标lncRNA Gas5的水平。结果显示，随着PS19小鼠年龄增长，其脑内Gas5水平下降。研究人员通过向PS19小鼠鼻内给予一种小分子，评估了阻断NMD介导的Gas5周转的后果。结果显示，NPC86使Upf1和Gas5解离，从而阻碍了NMD。NPC86治疗增加了雄性PS19小鼠皮层中的Gas5水平，同时pTau S214和神经炎症基因显著减少，并增加了胰岛素信号传导。因此，数字空间分析技术鉴定了受Gas5调节的基因和通路。NPC86治疗增强了神经元稳态、突触囊泡运输和线粒体功能，并下调了神经炎症通路。响应于NPC86，帕金森信号通路、多发性硬化症信号通路、Gα(s)信号通路、神经炎症信号通路和干扰素γ信号通路中的节点基因减少。该研究证明了选择性稳定NMD靶标lncRNA Gas5水平以减轻Tau蛋白病早期神经退行性病变的潜力。

Tau蛋白在脑内的病理性积累是进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病等Tau蛋白病的标志。NMD通路对于识别并靶向转录本进行周转至关重要，不仅降解异常转录本，还作为生理调节机制调控约10%的正常转录本（包括长链非编码RNA等）。Gas5作为一种受NMD调控的lncRNA，在正常脑内调节胰岛素信号传导。然而，在Tau蛋白病中，脑内NMD靶基因的失调仍鲜为人知。由于NMD核心机制在基因转录后调控及监测中具有中心作用，直接抑制核心NMD或耗竭其关键蛋白Upf1并不推荐。为此，研究人员开发了能够特异性结合Gas5 3′区域、阻断Upf1结合的小分子NPC86。前期研究已证实NPC86能跨越血脑屏障且无明显毒性。本研究旨在利用NPC86作为分子工具，评估在PS19转基因小鼠模型中阻断NMD介导的Gas5周转的后果，探究其延缓神经退行性病变的潜力。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

本研究的样本队列来源于从Jackson实验室购买的PS19转基因小鼠及非转基因（Ntg）同窝小鼠。研究人员采用的主要关键技术方法包括：NPC86鼻内给药；利用悬尾实验、Y迷宫、新物体识别和旷场实验进行行为学评估；采用液滴数字PCR（ddPCR）和SYBR Green qPCR进行基因绝对定量；运用免疫组织化学（IHC）、RNAscope和RNA荧光原位杂交联合免疫荧光（RNA-FISH/IF）进行组织定位与原位分析；通过GeoMx数字空间分析（DSP）进行空间转录组学研究；采用ProteinSimple Jess自动化蛋白质印迹和RNA免疫沉淀（RIP）分析蛋白表达及RNA-蛋白相互作用；并在过表达突变型tauP301L的HEK293细胞中进行转染验证。

研究结果如下：
2.1. PS19小鼠脑内Gas5水平较低
通过ddPCR和RT-qPCR评估，发现9个月大的PS19小鼠海马和皮层中Gas5水平较Ntg小鼠显著下降，皮层中下降尤为明显，且雄雌小鼠均表现出Gas5水平降低。
2.2. 鼻内给予NPC86增加PS19小鼠Gas5水平
通过长期和短期鼻内给药NPC86结合RT-qPCR和RNAscope评估，发现NPC86在雄性PS19小鼠皮层中显著增加Gas5水平，且对小鼠体重无影响，未显示脑或其他器官毒性。
2.3. NPC86阻断NMD介导的Gas5周转
通过RIP实验评估，发现PS19小鼠中Upf1与Gas5的结合较Ntg小鼠增加，而NPC86治疗阻断了这种结合，且未改变Upf1总水平。
2.4. NPC86治疗缓解神经元胰岛素信号并降低Tau磷酸化
通过Jess自动化蛋白质印迹分析，发现NPC86治疗增加了Akt磷酸化，显著降低了pTau S²¹⁴和pTau S^202/T205。RNA-FISH/IF显示Gas5与Tau-5的共定位减少。行为学测试表明NPC86改善了Y迷宫自发交替百分比及旷场运动能力。
2.5. NPC86治疗的PS19小鼠的数字空间分析（DSP）
通过GeoMx DSP分析皮层等区域，发现NPC86治疗引起了皮层中显著的基因表达变化，上调了与突触囊泡运输（如Vamp2）、线粒体功能（如Acot13, Tpi1）相关的基因，下调了神经炎症通路中的节点基因，涉及帕金森病、多发性硬化症、Gα(s)信号、神经炎症信号和干扰素γ信号通路。此外，通过生物信息学通路分析预测了NMDA受体的上调和电压门控钙通道的下调，表明Gas5对神经递质受体和离子通道具有调节作用。
2.6. 阻断失调的NMD介导的Gas5周转减少神经炎症
通过免疫荧光染色，发现NPC86治疗降低了Iba1和GFAP的染色，表明促炎性小胶质细胞和激活的星形胶质细胞减少。
2.7. DSP结果的验证
通过RT-qPCR验证了DSP分析中差异表达基因的表达模式，确认了神经炎症相关基因（如IFNα, IFNβ, TLRs, TNFα）的下调。
2.8. NPC86治疗中Gas5依赖性结果的验证
在过表达tauP301L的HEK293细胞中，通过转染GAS5 siRNA，发现NPC86降低pTau S²¹⁴的作用在GAS5耗竭后被消除，证实了NPC86对Tau磷酸化的影响具有Gas5依赖性。

在讨论部分，研究人员评估了NMD靶基因Gas5在Tau蛋白病小鼠模型中的作用。结果显示，阻断NMD通路增加了Gas5水平，并减缓了PS19小鼠年龄相关的神经退行性通路进展。Gas5作为一种多面性lncRNA，可作为支架辅助tau与激酶结合。NPC86治疗通过稳定Gas5，恢复了失调的胰岛素信号，减轻了神经退行性疾病的早期决定因素。DSP分析揭示了Gas5调节的多种基因和通路，如Trem2作为一种脂质受体，其下调可能损害小胶质细胞促进tau扩散的能力；NPC86增加Ube2n水平，提示可能促进了受损线粒体的自噬破坏；而增加Dbi水平有助于抑制异常神经元兴奋性。不过研究存在局限性，如雌性PS19小鼠对NPC86无显著反应，未评估tau播种及特定胶质细胞中NMD的作用，这些将在未来研究中深入。

结论部分表明，PS19小鼠存在失调的神经元网络，抑制NMD介导的Gas5周转通过影响大脑代谢、突触囊泡运输、线粒体功能和神经网络内的细胞骨架组织来增强神经元稳态，并减少神经炎症。该研究确立了NMD通路在发展Tau蛋白病中的关键作用，支持了通过选择性调节NMD通路的转录本周转以提高关键lncRNA水平来延缓神经退行性疾病发生的潜力。