《Neuron》：A bifunctional optical reporter for tracking estrogen response dynamics in neurons
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用于追踪雌激素作用动态的方法有限且不具有组织特异性；这些特征使得难以将激素变化与生理、行为和神经变量直接关联。为解决这一问题，研究人员开发了荧光双功能报告器neuro-seeER（“see estrogen response”），其可用于在体外和体内追踪雌激素
用于追踪雌激素作用动态的方法有限且不具有组织特异性；这些特征使得难以将激素变化与生理、行为和神经变量直接关联。为解决这一问题，研究人员开发了荧光双功能报告器neuro-seeER（“see estrogen response”），其可用于在体外和体内追踪雌激素动态变化，包括在行为动物中的纵向追踪。研究人员证明，该活性需要雌激素受体（estrogen receptor, ER）表达，对雌二醇（estradiol）具有特异性，并在体内对外源性雌激素作出动态响应。利用“快照”光度法（snapshot photometry）进行纵向动态追踪，研究人员检测到多个下丘脑位点之间协调的外源性雌激素反应。最后，研究人员证明该工具能够在发情周期（estrous cycle）时间尺度上捕获体内内源性雌激素反应动态，从而揭示反应时间的个体差异。总之，这些发现揭示了雌激素反应性中意想不到的细胞和时间异质性，并证明了将激素反应与神经或行为测量并行追踪的可行性。
论文解读：双功能光学报告器揭示神经元雌激素反应动态
雌激素是高度动态的激素，其水平变化在生理和行为中发挥重要作用。然而，目前追踪其体内动态作用的方法有限且缺乏组织特异性，难以将激素变化与神经、行为和生理变量直接关联。传统方法通常依赖于测量循环激素水平和检测靶组织中受体的表达，但这些方法忽视了位点特异性合成、受体信号的时间尺度以及不同组织与细胞类型间的异质性。此外，循环雌激素水平并不能充分反映实际效应，因为核受体及辅因子的动态表达和翻译后修饰等因素均可影响细胞信号。因此，开发能够在不同脑区且跨越分钟至数月时间尺度动态追踪雌激素信号的光学工具，是该领域亟待解决的技术缺口。
为填补这一空白，研究人员开发了一种改进的双功能报告器neuro-seeER（“see estrogen response”）。该报告器同时携带Cre依赖的FusionRed（红色荧光蛋白）和雌激素反应元件（ERE）驱动的d2EGFP（去稳定化增强型绿色荧光蛋白，半衰期约2小时），从而能够在Esr1-Cre小鼠中分别标记雌激素敏感性（ER表达）和雌激素反应性（ERE转录活性）神经元。研究在体外验证了该报告器的配体特异性和受体特异性，并在体内证明其可追踪外源性和内源性雌激素波动，且与常规光纤光度法、测序和显微镜技术兼容。该工作发表在《Neuron》。
主要关键技术方法包括：构建双功能AAV载体（含Cre依赖的hSyn-FLEX-FusionRed和8xERE-mCMV-d2EGFP）；在293T细胞中通过受体共转染和类固醇配体处理，利用Incucyte自动荧光显微镜进行时间序列成像；对Esr1-Cre小鼠（C57BL/6J背景用于固定组织实验，CD1背景用于光电记录）进行立体定位注射，靶向内侧视前区（MPO）和腹内侧核腹外侧部（VMHvl）；结合免疫组化和单细胞荧光定量；采用流式细胞术分选并进行bulk RNA测序（flow-seq）；使用“快照”光纤光度法（每5分钟交替470/560 nm脉冲）在自由活动小鼠中纵向记录信号；并利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测量卵巢、血清和脑区的雌激素水平。激素水平测量使用不同发情周期阶段的野生型C57BL/6J雌性小鼠。
结果部分可概括为以下三个发现。第一，体外seeER表达具有配体特异性、受体特异性和动态性。通过在293T细胞中共转染seeER与ERα或ERβ，研究人员观察到17β-雌二醇（E2）处理可显著增加EGFP阳性细胞数，而糖皮质激素受体或雄激素受体转染组不响应；5α-二氢睾酮也不能诱导反应。E2的最低有效浓度为100 pM，接近其与ERα的解离常数，且不同浓度下反应的时间动力学相似。
第二，体内下丘脑neuro-seeER表达可被雌激素处理动态诱导。在去卵巢（OVX）Esr1-Cre小鼠的MPO注射雌二醇苯甲酸酯（EB）后，6和16小时出现亮绿色神经元。通过flow-seq，研究人员将EGFP高表达的神经元与低表达组比较，鉴定出834个差异表达基因，其中富集已知雌激素反应基因如Pgr、Igf1和Oxtr，以及立即早期基因程序，表明该工具可用于下游转录组分析。
第三，neuro-seeER动态响应发情周期中的内源性雌激素波动。LC-MS/MS测量显示血清和脑区E2水平在发情前期达峰；VMHvl中EGFP阳性神经元数量在间情期和发情前期高于发情后期，而相邻VMH中央区和背内侧区无此变化。在MPO，E2水平有周期变化，但EGFP阳性神经元数量无显著周期差异。长期光电记录进一步显示，VMHvl和MPO信号在间情期和发情前期升高，但峰值时间存在个体差异，且同时记录的两个区域信号相关，表明它们响应同一内源激素波动。
讨论部分指出，neuro-seeER基于早期ERE-luciferase和ERE-GFP系统
