《Aquatic Toxicology》：The zebrafish embryo as a potential 3R-compliant model to identify endocrine activity across estrogenic, androgenic and steroidogenic (EAS) modalities
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内分泌干扰化合物（EDCs）是指能够干扰激素系统的物质，对野生动物和人类健康构成风险。对于野生动物而言，一种物质必须在相关靶点（受体或酶）上表现出内分泌活性，并作为直接后果，在受暴露生物体或其后代中引起与种群相关的不利影响，才能被归类为EDC。当前的监管框架利
内分泌干扰化合物（EDCs）是指能够干扰激素系统的物质，对野生动物和人类健康构成风险。对于野生动物而言，一种物质必须在相关靶点（受体或酶）上表现出内分泌活性，并作为直接后果，在受暴露生物体或其后代中引起与种群相关的不利影响，才能被归类为EDC。当前的监管框架利用各种体内试验来识别与雌激素、雄激素和类固醇生成（EAS）模式相关的潜在EDCs。然而，伦理方面的关注日益推动监管方法与3Rs原则（优化、减少、替代）保持一致，以减少对基于动物的测试系统的依赖。本研究探讨了非转基因鱼类胚胎中转录组学作为符合3R原则的补充筛选方法的潜力，并提出一个概念框架，用于识别所有三种EAS模式的内分泌活性。研究人员汇编了与EAS模式相关的已知基因网络概述，并绘制了早期胚胎发育期间基因表达和功能的公开文献数据。研究发现，在受精后96小时内，斑马鱼胚胎天然表达许多参与性别激素生物合成、雌激素和雄激素受体信号通路的关键酶和受体编码基因。此外，斑马鱼胚胎还表达EAS相关通路中的基因，即盐皮质激素、糖皮质激素、孕酮和葡糖醛酸基化通路。尽管现有的转录组学和功能数据表明，鱼类胚胎原则上能够产生指示内分泌活性的转录反应，但目前可用的信息不足以识别与内分泌活性普遍相关或特定于EAS模式的稳健、特异且具有机制依据的生物标志物。为解决这一问题，研究人员提出对EAS模式的额外内分泌活性物质进行系统的经验性转录组反应评估。
**论文解读：斑马鱼胚胎作为3R合规模型在EAS内分泌活性识别中的潜力评估**
**1. 研究背景与问题提出**
内分泌干扰化合物（EDCs）能够干扰激素系统，对野生动物和人类健康构成风险。现行监管框架主要依赖成鱼体内试验来评估物质的雌激素、雄激素和类固醇生成（EAS）模式内分泌活性。然而，这些基于成鱼的试验（如鱼类短期繁殖试验，FSTRA；OECD TG 229）消耗大量成年动物，例如一次试验最少需要80条成年斑马鱼或96条黑头呆鱼或青鳉，这引起了显著的伦理关切。3Rs原则（优化、减少、替代）的推广促使科学界寻求替代方法。现有符合3R原则的转基因胚胎试验（如EASZY、RADAR、REACTIV）虽已获OECD认可，但每个试验仅针对单一模态，且依赖外源报告基因构建。因此，研究人员提出一个关键问题：是否可以利用野生型斑马鱼胚胎在96小时受精后（hpf）这一符合3R原则的时间窗口内，通过转录组学方法，建立一种模态无关的筛选系统，以同时覆盖所有EAS模式的内分泌活性识别。
**2. 研究方法概述**
该研究主要采用了两大关键技术方法：（1）**定向文献综述与数据库挖掘**：利用KEGG数据库（KEGGREST包）和ZFIN数据库，系统检索斑马鱼（Danio rerio）中与激素合成（dre00140）和激素信号传导（dre04081）相关的通路及基因，并通过文献检索补充雄激素受体信号通路信息。（2）**定量表达图谱比较分析**：利用EMBL Expression Atlas公开数据集（E-ERAD-475，White et al., 2017），该数据集涵盖0至120 hpf的18个发育阶段（每时间点5个重复，每重复12个混合胚胎），以转录本每百万映射读数（TPM）为单位，通过R语言和heatmaply包可视化分析内分泌相关基因的时序表达模式。样本来源于野生型斑马鱼胚胎。
**3. 研究结果**
**3.1 EAS生物合成与信号通路概述**：研究确认斑马鱼胚胎表达类固醇激素生物合成所需的完整酶系，包括盐皮质激素、糖皮质激素、孕酮、性激素合成通路，以及葡糖醛酸基化通路。KEGG通路分析显示，胆固醇代谢（dre00100）和孕酮介导的卵母细胞成熟（dre04914）因属于上游过程或下游生殖事件而排除。
**3.2 初级EAS相关通路**：
**3.2.1 性激素生物合成**：表达分析显示，cyp11a1.1在0-24 hpf高表达，而cyp11a1.2在48-120 hpf高表达，且两者均为胆固醇侧链裂解酶关键基因。hsd3b1和hsd3b2呈互补表达模式，前者在0-5.25和30-96 hpf双峰表达，后者仅在5.25-48 hpf表达。cyp17a1和cyp17a2在囊胚期（4-6 hpf）达到表达峰值。芳香化酶cyp19a1a/b在96 hpf后达到最大表达，其中cyp19a1b在6-8 hpf另有表达峰，支持其在早期神经内分泌信号中的假设作用。hsd17b12b和hsd17b7催化雌酮转化为雌二醇（E2），在囊胚至原肠胚期高表达。hsd11b2（11-酮基睾酮，11-KT合成关键酶）和srd5a2b、srd5a1均在96 hpf达到表达峰值。
**3.2.2 雌激素与雄激素信号传导基因**：斑马鱼胚胎从受精卵至96 hpf均表达esr1、esr2a、esr2b、gper和ar等核受体基因。这些受体可作为母源性转录本存在，合子表达始于24 hpf。配体结合后激活下游含雌激素反应元件（ERE）或雄激素反应元件（ARE）的基因，如vtg、cyp19a1b、lhbeta和zp3.1。EASZY试验（OECD TG 250）的体内验证证据表明，雌激素信号通路在早期胚胎中功能活跃。
**3.3 EAS连接通路**：
**3.3.1 盐皮质激素生物合成**：cyp21a2自36 hpf开始表达，96 hpf后达峰值；盐皮质激素受体（nr3c2）自12 hpf起持续表达至96 hpf后，表明96 hpf时该通路潜在功能完整。
**3.3.2 糖皮质激素生物合成**：糖皮质激素受体（nr3c1）自早期合子期表达，72 hpf后达峰。hsd11b2兼具11-KT合成和皮质醇灭活双重功能，其表达在96 hpf达峰，与皮质醇水平显著上升（24-120 hpf）的时间一致。hsd20b2自4 hpf起表达至96 hpf，参与皮质醇代谢。
**3.3.3 孕酮生物合成**：孕酮代谢产物由srd5a家族合成。核孕酮受体（nr3c3）仅在4-24 hpf短暂表达，但膜结合孕酮受体（paqr6、paqr7a、paqr9、paqr7b）在96 hpf达峰，提示膜受体可能在幼体阶段介导孕酮信号。
**3.3.4 性激素排泄与运输**：已鉴定8个ugt基因在24-120 hpf期间表达，其中ugt5a5和ugt1b1对双酚A（BPA）等外源底物具有显著酶活性。shbg（性激素结合蛋白）在早期发育阶段的表达数据尚不一致，其功能活性有待确认。
**3.4 现有功能学证据**：基因敲低/敲除研究证实了多个基因的功能：cyp11a2敲低后可通过孕烯醇酮补充恢复类固醇生成；cyp21a2敲低导致皮质醇降低和HPI轴上调；esr2a敲低引发胚胎神经凋亡。转基因斑马鱼品系tg(cyp19a1b-GFP)（EASZY试验基础）对E2、EE2等雌激素物质在96 hpf内表现出显著反应。
**3.5 斑马鱼胚胎内分泌活性物质初步研究**：现有转录组研究一致显示cyp19a1b和vtg1是最稳健的内分泌响应基因，hsd17b12a、lhbeta和zp3.1也反复被报道为响应基因。zp3.1在青鳉中的直系同源物choriogenin 1（chgH1）是REACTIV试验（OECD TG 249）的分子终点。然而，现有研究存在方法学异质性（暴露浓度、采样时间、测序平台差异），且缺乏类固醇生成模态物质的数据，尚不足以建立模态特异性转录组指纹。
**4. 结论与展望**
**研究结论**：研究人员提出96 hpf作为转录组分析的最佳采样时间点，这基于两方面考量：一是该时间点所有类固醇生成和激素信号传导的关键组分均已表达；二是该时间点在监管接受范围内符合3R原则。研究人员提出的概念框架建议采用靶向内分泌特异性基因标签（gene signature），结合转录组出发点（tPOD）建模，并通过非内分泌作用模式物质（如卡马西平、对乙酰氨基酚、双氯芬酸）进行反验证，以提高特异性。最终，96 hpf斑马鱼胚胎转录组学试验有望成为鱼类短期繁殖试验（FSTRA）的符合3R原则的早期补充筛选方法。该研究为建立模态无关的斑马鱼胚胎内分泌活性筛选系统提供了概念基础，但后续仍需系统的参考化合物暴露研究和实验室间验证来建立稳健、特异且具有机制依据的生物标志物组合。
