环烷酸分馏化合物破坏虹鳟鱼原代肝细胞的能量代谢，刺激活性氧产生并诱导坏死

《Aquatic Toxicology》：Naphthenic acid fraction compounds disrupt bioenergetics, stimulate ROS, and induce necrosis in rainbow trout primary hepatocytes

　　

摘要

环烷酸组分化合物（NAFCs）是油砂过程影响水（OSPW）中的成分，已被证实会损害鱼类的线粒体生物能量学。本研究使用模型金刚烷NAFC——3,5-二甲基金刚烷-1-乙酸，以及从风化OSPW中提取的NAFC混合物，对虹鳟鱼（大鳞鲑）原代肝细胞中的呼吸作用、活性氧（ROS）生成、能量状态和细胞死亡的影响进行了测试。肝细胞暴露24小时后，使用高分辨率呼吸仪和荧光法（Oroboros Oxygraph-2k FluoRespirometer）量化耗氧量和过氧化氢（H₂O₂）排放，同时采用互补的发光/荧光生物测定法量化细胞内三磷酸腺苷（ATP）（CellTiter-Glo?）以及凋亡/坏死（RealTime-Glo? Annexin V）。两种NAFC来源均以浓度依赖方式抑制细胞耗氧，其中模型NAFC的效力（IC₅₀ 3.36 mM）强于OSPW来源的混合物（IC₅₀ 6.7 mM）。两种NAFC来源均增加了肝细胞中的H₂O₂排放，在呼吸仪测定中效力相似（商用NAFC和提取NAFC的EC₅₀分别为6.05和8.43 mM）。ATP在低毫摩尔浓度下即被耗竭（模型NAFC的IC₅₀为0.78 mM；提取NAFC为1.77 mM）。细胞死亡分析显示坏死为主要结果，在测试的NAFC暴露浓度范围内，凋亡证据有限或不一致。与完整肝细胞相比，分离的线粒体对商用NAFC在呼吸抑制和H₂O₂生成方面表现出显著更高的敏感性。这些发现表明，NAFC对肝细胞的毒性通过偶联的生物能量抑制和氧化紊乱协同介导，最终导致ATP耗竭和坏死性细胞死亡，并支持金刚烷羧酸作为选定油砂NAFC的潜在机制替代品，同时认识到OSPW混合物在组成上具有复杂性。

引言

环烷酸，更广泛地称为环烷酸组分化合物（NAFCs），是一类通过石油开采特别是油砂开采引入水生环境的复杂羧酸家族（Vander Meulen等人，2025年）。NAFCs可能占原油总质量的5%，当释放到环境中时可能成为主要的有毒物质（Seifert和Teeter，1969年；Frank等人，2021年；Headley和McMartin，2004年）。露天开采油砂的提取主要通过苛性热水提取完成，产生的废料——油砂过程影响水（OSPW）——富含NAFCs。尽管实施了零排放政策，NAFCs仍在阿尔伯塔油砂阿萨巴斯卡地区的表面水中被检测到（Frank等人，2021年；Headley和McMartin，2004年；Arens等人，2017年）。鉴于尾矿水储量不断增加，无限期储存是不可能的，尾矿水的安全释放势在必行（van den Heuvel，2015年）。然而，为此必须将OSPW处理到环境风险可忽略不计的程度，这就要求更好地理解混合物各成分的毒性。

NAFCs已被确定为OSPW中的主要成分，负责急性致死性（Verbeek等人，1993年），并可能影响慢性毒性。然而，NAFC毒性背后的细胞机制尚未完全阐明（Clemente和Fedorak，2005年）。NAFC毒性已在鱼类模型中进行研究，包括虹鳟（大鳞鲑）（Kalvani等人，2024年）、异育银汉鱼（纵纹鱼）（Marentette等人，2015年）、斑马鱼（斑马鱼）（Scarlett等人，2013年）和黄背鱼（黄鲈）（Reynolds等人，2024年）。这些研究报告称，暴露于NAFCs的鱼类其存活率、平衡能力、繁殖活动和内分泌功能均受损。在黄背鱼中，NAFC暴露降低了行为试验期间的存活率和平衡能力，表明机体功能受损（Reynolds等人，2024年）。在异育银汉鱼中，21天暴露于NAFC提取物后产卵活动和血浆性类固醇浓度降低，证明了内分泌干扰作用（Kavanagh等人，2012年）。

在细胞器水平上，使用分离的肝线粒体的研究表明，肝线粒体暴露于提取的和商用的NAFCs均会导致线粒体功能障碍和生物能量学受损（Rundle等人，2018年；Rundle等人，2021年；Kalvani等人，2024年；Kalvani等人，2025年）。这些研究一致表明氧化磷酸化降低和活性氧（ROS）产生增加，提示NAFCs破坏了线粒体效率和氧化还原平衡。尽管细胞器水平的分析提供了有价值的机制见解，但它们不能完全捕捉NAFC毒性的细胞复杂性，凸显了在完整细胞中进行补充研究的必要性，因为近期研究表明NAFC毒性可能涉及复杂通路（Zhou等人，2026年）。在完整细胞中，ATP耗竭可能损害膜完整性并促进坏死性细胞死亡。相比之下，凋亡是一种能量依赖且受调控的细胞死亡形式，可能由ROS升高促进。

原代肝细胞是评估NAFC毒性的相关模型，因为肝脏在外来物代谢、细胞能量调节和线粒体毒理学中起着核心作用。选择新分离的原代肝细胞而非已建立的细胞系，是因为它们保留了物种特异性的肝脏代谢、线粒体功能和整合的细胞反应。尽管需要活的虹鳟作为肝细胞供体，但这种离体方法允许在受控的生理条件下使用完整的、代谢活跃的细胞检查多个机制终点。Petersen等人（2017年）研究了与石油污染物相关的化合物（包括羧酸）对虹鳟肝细胞的影响，报告称非特异性细胞毒性与化学疏水性相关。同样，Tollefsen等人（2012年）通过评估类似NAFC物质对代谢抑制和膜完整性的影响，证明了类似NAFC的物质对鱼肝细胞有毒性。使用McA-RH7777大鼠肝细胞模型，暴露于NAFCs后改变了能量稳态，细胞能量动态的变化可能与线粒体功能降低有关（Jamshed等人，2025年）。总之，这些发现支持使用完整肝细胞来确定NAFC诱导的线粒体效应是否转化为细胞呼吸改变、ATP耗竭、ROS产生和细胞死亡。

归因于NAFCs的广泛体内干扰可能源于细胞和亚细胞功能障碍，特别是在肝线粒体中。我们假设NAFC暴露会损害细胞呼吸、增加ROS产生、降低细胞内ATP水平并在虹鳟原代肝细胞中诱导细胞死亡，其中坏死预计比凋亡更为突出。为检验这一假设，本研究考察了模型NAFC 3,5-二甲基金刚烷-1-乙酸和从OSPW中提取纯化的NAFC混合物对虹鳟原代肝细胞中细胞呼吸、ROS产生、ATP水平和细胞死亡通路的影响。虹鳟（大鳞鲑）原代肝细胞暴露于不同浓度的两种NAFC来源。使用高分辨率呼吸仪和荧光法测量细胞呼吸和过氧化氢（H₂O₂）产生（作为ROS的替代指标），并通过ATP、凋亡和坏死生物测定评估细胞死亡机制。比较模型化合物和OSPW来源混合物的反应，以确定定义的金刚烷羧酸是否能重现复杂环境混合物的细胞效应，从而可作为选定OSPW来源NAFCs的机制替代品。在呼吸作用、ROS、ATP、凋亡和坏死终点之间进行比较，以确定线粒体和细胞反应是否形成生物能量破坏和细胞死亡的连贯序列。最后，与既往分离线粒体研究进行比较，以确定细胞器水平的效应在完整肝细胞中是否也会发生，以及细胞屏障和保护系统是否改变了NAFC的效力。

章节摘要

实验设计

使用高分辨率呼吸仪和荧光法同时测量耗氧量和ROS排放，考察3,5-二甲基金刚烷-1-乙酸（Sigma Aldrich，加拿大Oakville；CAS编号14202-14-3）和从OSPW中提取的NAFC混合物对完整虹鳟肝细胞中细胞呼吸和H₂O₂排放的影响。研究根据暴露时间、肝细胞状态（完整与通透）分为不同的实验体系。

结果

在暴露24小时的肝细胞中，各处理组的平均细胞活力对于OSPW来源的NAFC混合物范围在93.1%至97.6%之间，对于商用NAFC 3,5-二甲基金刚烷-1-乙酸范围在77.6%至99.1%之间。OSPW来源的NAFC混合物各处理组之间活力无统计学显著差异，但商用NAFC仅在最高浓度组显示出与溶剂对照相比的细胞活力显著降低（p < 0.05）。绝对对照

讨论

一种模型金刚烷NAFC和一种源自风化油砂OSPW的NAFC混合物显示出类似的氧化磷酸化降低模式，表现为耗氧量降低和ROS排放增加，这在虹鳟肝细胞中表现明显。这一模式在分离的虹鳟线粒体和原代肝细胞中均一致。虹鳟中细胞能量代谢的紊乱导致ATP耗竭。细胞死亡的主要途径为坏死，通过膜

作者贡献声明

Zahra Kalvani：概念化、方法学、验证、正式分析、调查、数据管理、可视化、撰写——初稿、撰写——审阅与编辑。Pius Tetteh：调查。

Chidozie Okoye：调查、撰写——审阅与编辑。Collins Kamunde：方法学、监督、撰写——审阅与编辑。Don Stevens：方法学、监督、撰写——审阅与编辑。Michael R. van den Heuvel：概念化、方法学、验证、正式分析、资源，

利益冲突声明

作者声明不存在已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

作者声明

所有作者对研究的概念、设计、数据收集、分析和解释均作出了实质性贡献。所有作者均已审阅并批准最终手稿，同意将其投稿至《水生毒理学》。所有作者同意对所有方面的工作负责。

本手稿为原创，此前未曾发表，且未在其他地方同时接受审稿。

所有涉及动物的实验程序均在

未引用参考文献

Kavanagh等人，2011年；Lemasters等人，1999年；Li和Xie，2018年；Rogers等人，2002年；Rowland等人，2011a；Rowland等人，2011b；Tollefsen等人，2008a；Tollefsen等人，2008b；Tollefsen等人，2006年；Zhihao等人，2022年

作者贡献声明

Zahra Kalvani：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。Pius A. Tetteh：调查。Collins Kamunde：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、经费获取。Don Stevens：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。Chidozie Okoye：撰写——审阅与编辑、调查。Michael R. van den Heuvel：撰写——审阅与编辑、可视化，

Zahra Kalvani|Pius A. Tetteh|Collins Kamunde|Don Stevens|Chidozie Okoye|Michael R. van den Heuvel

大西洋兽医学院，生物医学科学系，爱德华王子岛大学，加拿大夏洛特敦