《Applied and Environmental Microbiology》：Semi-automated strain engineering and screening in the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila for recombinant protein production
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嗜热丝状真菌广泛用于高温条件下的纤维素酶生产；然而，由于大量转化子群体的构建和筛选仍然困难，这些生物体中高效的 recombinant protein（重组蛋白）生产仍然受限。在本研究中，研究人员通过组合敲除与蛋白水解、囊泡运输和分泌相关的基因，将嗜热毁丝霉（
嗜热丝状真菌广泛用于高温条件下的纤维素酶生产；然而，由于大量转化子群体的构建和筛选仍然困难，这些生物体中高效的 recombinant protein（重组蛋白）生产仍然受限。在本研究中，研究人员通过组合敲除与蛋白水解、囊泡运输和分泌相关的基因，将嗜热毁丝霉（*Myceliophthora thermophila*）改造成嗜热真菌底盘，获得了超高产分泌菌株。优化的表达盒与漆酶（laccase）报告基因相结合，实现了基于活性的生产性转化子鉴定。迭代基因组工程与 QPix 辅助菌落挑选相结合，实现了真菌转化子的平行回收与筛选，在转化和稀释涂布后回收了 552 个菌落，并进一步通过基于 ABTS 的平板筛选评估了 96 个转化子。在 *MtLacA* 位点的靶向整合通过漆酶活性的丧失实现了生产性重组体的鉴定，且转化子经常携带多拷贝整合。通过迭代筛选和菌株改良，以葡萄糖为碳源，摇瓶培养中细胞外蛋白产量达到约 1.1 g/L，初步 5-L 发酵 144 h 后达到 5.9 g/L。该底盘还支持重组真菌酶和猪生长因子的分泌。总体而言，这些结果为嗜热丝状真菌中重组蛋白生产和菌株工程建立了一个实用的半自动化工作流程。
**背景与问题**
丝状真菌因其强大的细胞外蛋白分泌能力和在植物源底物上的生长特性，被广泛用作酶、蛋白质、有机酸及生物燃料等生化产品的工业宿主。木霉属（*Trichoderma*）、曲霉属（*Aspergillus*）和青霉属（*Penicillium*）等菌株的开发已取得显著进展，真菌纤维素酶和淀粉酶在木质纤维素生物转化和淀粉加工等产业中具有重要应用价值。嗜热丝状真菌则提供了额外的工业优势，包括更高的生长温度、更低的冷却需求、较低的污染风险，以及能够在苛刻加工条件下保持活性的热稳定酶。嗜热子囊菌嗜热毁丝霉（*Myceliophthora thermophila*，异名 *Thermothelomyces thermophilus*）因基因组和多组学分析揭示其含有大量参与木质纤维素降解的碳水化合物活性酶而备受关注。然而，尽管遗传操作工具如CRISPR-Cas9和Cas12a系统、2A肽表达策略及碱基编辑工具已显著提升了该菌株的可操作性，但高效构建和筛选大量真菌转化子群体仍然是主要瓶颈。丝状真菌通常表现出比细菌和酵母更低的转化效率、更慢的菌落发育和更大的形态异质性，自动化菌落回收和表型筛选方法也尚不成熟，导致迭代基因组工程仍高度依赖人工操作。因此，亟需开发一种结合多基因底盘工程、平行转化子处理和活性筛选的综合策略。
**研究内容与意义**
针对上述问题，研究人员开发了一种嗜热真菌底盘和半自动化筛选工作流程，用于在嗜热毁丝霉中进行重组蛋白生产。通过连续敲除八个与蛋白水解、囊泡运输及分泌调控相关的基因构建了底盘菌株GM8，该菌株在Avicel、淀粉和葡萄糖条件下均表现出显著提高的细胞外蛋白分泌水平。将优化的表达元件与基于ABTS的显色测定相结合，用于筛选产漆酶转化子。标记回收基因组编辑与QPix辅助菌落挑选相结合，实现了转化后真菌菌落的平行处理。在一个工程轮次中回收并进行了抗性验证553个菌落，其中96个转化子通过基于ABTS的平板筛选进一步评估。所得的M10-OEMtLacA菌株在摇瓶培养中产生约1.1 g/L细胞外蛋白，在初步5-L发酵中达到5.9 g/L。该底盘还支持真菌酶和猪生长因子的分泌。该研究发表于《Applied and Environmental Microbiology》，为嗜热丝状真菌中重组蛋白生产和迭代菌株工程提供了实用的半自动化工作流程。
**主要技术方法**
研究人员主要采用了以下关键技术方法：基于CRISPR/Cas9的标记回收基因组编辑策略，用于在嗜热毁丝霉中进行连续多基因敲除和表达盒整合；结合稀释涂布的转化子回收和QPix 420自动菌落挑选系统实现菌落的平行分离与处理；基于ABTS氧化的显色平板筛选和反筛策略鉴定产漆酶转化子及目标重组子；以及用于表达盒拷贝数评估的定量PCR和全基因组重测序分析。样本包括野生型菌株ATCC 42464及其衍生工程菌株。
**结果与讨论**
**多基因工程构建高产分泌底盘**
研究人员基于前期研究，首先敲除了*Mtexo-1*、*Mtstk-12*、*Mtspr-14*和*Mtap3m*四个基因构建中间菌株GM4，随后进一步敲除*Mtalp-1*、*Mtdsc-1*、*Mtdsc-2*和*Mtsah-2*构建八基因突变体GM8。在Avicel、淀粉和葡萄糖三种碳源下培养5天和7天后，GM4的细胞外蛋白产量显著高于野生型，而GM8在所有条件下均表现出最高分泌水平。培养7天后，GM8在Avicel培养基中的蛋白水平约为野生型的8倍，葡萄糖培养基中接近9倍。酶活测定显示，相对于野生型，GM8的CMCase、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶活性分别提高约7.3倍、7.1倍和9.5倍。研究表明，*Mtsah-2*和*Mtstk-12*可能对GM8的高分泌表型贡献较大，但由于GM8包含多个工程缺失，各突变的具体贡献仍需进一步分析。值得注意的是，GM8在葡萄糖条件下仍保持高细胞外蛋白产量，而野生型仅分泌少量蛋白，这一特性有利于降低内源酶背景、便于重组蛋白的检测，支持GM8作为异源蛋白表达底盘的应用。
**GM8底盘菌株中真菌漆酶的表达与基于ABTS的筛选**
以同源真菌漆酶MtLacA作为靶蛋白，构建了含有组成型启动子Ppdc、合成5‘-UTR（NCA-7d）和天然MtLacA信号肽的表达盒并导入GM8。转化子在含ABTS的平板上筛选，产活性漆酶的菌落因ABTS氧化而呈现明显绿色晕圈。SDS-PAGE分析显示GM8-OEMtLacA菌株在约75 kDa处出现明显细胞外蛋白条带，Western blot进一步确认了MtLacA的分泌。各转化子间漆酶活性差异显著，菌株M4活性最高，约为1,201 U/L。qPCR分析显示MtLacA拷贝数为4至7个，拷贝数较高的转化子通常表现出较强的漆酶活性，但并非严格正比，表明基因组位置效应等因素也影响表达差异。
**QPix辅助筛选及工程化产漆酶菌株的表征**
为进一步提高漆酶产量，将MtLacA表达盒重新导入GM8-OEMtLacA-M4菌株，同时将筛选标记从bar转换为neo，并敲除转录因子基因*MtRes1*。在单个工程轮次中，通过稀释涂布和QPix处理回收了553个真菌菌落，其中96个转化子经ABTS平板筛选。T64菌株表现出最高的细胞外蛋白积累，约为GM8-OEMtLacA-M4的3.5倍。在葡萄糖摇瓶培养中，T64的细胞外蛋白达到约1.1 g/L。在初步5-L发酵罐中，生物量在约96 h后接近平台期，而细胞外蛋白持续积累，144 h时达到约5.9 g/L。T64的漆酶活性约为5,038 U/L。qPCR和全基因组重测序分析表明，MtLacA拷贝数从GM8-OEMtLacA-M4中的约7个增加到工程菌株中的10至12个，与漆酶活性增加趋势一致。此外，GM10-OEMtLacA菌株在碱性木质素和脱碱木质素上的生物量积累较GM8有所增加。
**筛选底盘菌株中重组真菌酶的生产**
以黑曲霉（*A. niger*）葡萄糖氧化酶GoxM和埃默森篮状菌（*Talaromyces emersonii*）葡糖淀粉酶TeGlaA作为代表性工业酶，通过CRISPR/Cas9介导的敲入将M10-OEMtLacA中的MtLacA表达盒替换为目标表达构建体。由于替换导致ABTS氧化活性丧失，重组转化子可通过ABTS反筛轻松鉴定。在每种异源蛋白筛选的90个转化子中，19个RS-GoxM转化子（21.1%）和20个RS-TeGlaA转化子（22.2%）表现出阳性ABTS平板表型。最高产的RS-GoxM菌株细胞外蛋白约达521 mg/L，最佳RS-TeGlaA菌株约达636 mg/L。RS-GoxM-T3的葡萄糖氧化酶活性最高（约786 U/mL），所有代表性RS-GoxM转化子中残留漆酶活性均接近背景水平。RS-TeGlaA-T3的葡糖淀粉酶活性最高（约2,245 U/g生物量）。拷贝数分析显示goxM和TeGlaA均以约7至11个拷贝整合。研究指出，基因拷贝数之外的顺式或反式调控因素也可能影响重组蛋白的生产和活性。
**工程化真菌底盘生产猪生长因子及融合蛋白**
研究人员进一步评估了该底盘对猪表皮生长因子（EGF）和转化生长因子β1（TGFβ1）的分泌能力，并构建了TGFβ1-EGF融合蛋白。表达构建体带有N端分泌信号、6× His标签和肠激酶切割位点以利于下游纯化。摇瓶培养后，SDS-PAGE和Western blotting在重组菌株中检测到对应EGF和TGFβ1预期分子量的蛋白条带，而宿主对照中不存在。经Ni-NTA纯化、肠激酶消化和超滤后，获得对应于预期分子大小的纯化蛋白。RS-EGF菌株的重组蛋白产量约为37至114 mg/L，RS-TGFβ1菌株的最佳转化子达约142至201 mg/L。TGFβ1-EGF融合蛋白在多个转化子中约为65至87 mg/L。虽然研究未评估重组生长因子的生物活性，但成功分泌和回收表明该底盘与结构多样的重组蛋白生产兼容。
**讨论与结论**
该研究建立的半自动化工作流程显著提高了转化子回收和筛选能力。传统丝状真菌转化子筛选依赖人工菌落分离，可平行处理的候选数量有限；而QPix辅助菌落挑选与ABTS活性筛选相结合，使单个工程轮次可回收超过500个转化子并平行评估96个转化子。研究结果表明，M10-OEMtLacA底盘支持包括真菌酶、生长因子和融合蛋白在内的不同重组蛋白的表达与分泌。在单轮工程中通过稀释涂布回收和QPix辅助菌落分离共回收处理553个真菌菌落，96个转化子经ABTS平板筛选。MtLacA位点的靶向替换和ABTS反筛为通过漆酶活性丧失鉴定候选重组体提供了便捷的表型策略。该策略常产生携带多拷贝整合（通常约10拷贝）的转化子。通过迭代筛选和菌株改良，摇瓶培养中细胞外蛋白产量达到约1.1 g/L，初步5-L发酵中达到5.9 g/L。总体而言，该工作将迭代基因组工程与半自动化菌落分离和基于活性的筛选相结合，不是通过提高内在转化效率，而是通过改善转化子回收、菌株评估和筛选通量来推进真菌菌株工程。该策略可为其他丝状真菌中开发半自动化工程工作流程和重组蛋白生产系统提供实用参考。
