德国肉类加工设施中与Listeria spp.检测相关的环境微生物群落特征

《Applied and Environmental Microbiology》：Environmental microbial community signatures associated with Listeria spp. detection in German meat processing facilities

　　

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）尽管经过常规清洁和消毒，仍可在肉类加工环境的生态位中持续存在。其持久存在可能不仅取决于应激耐受性，还取决于与常驻微生物群落的相互作用，这些相互作用可能促进或抑制其存活。然而，这些生态关系仍知之甚少。研究人员结合16S rRNA V3/V4扩增子测序、培养检测和多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST），对六家德国肉类加工设施一年内的微生物群落进行了表征。研究人员考察了群落结构、采样位点与Listeria spp.（含L. monocytogenes）出现之间的关联。微生物群落以食品加工环境中典型的核心属为主，尤其是假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter），但不同设施间存在显著差异（PERMANOVA，P = 0.001；两两R² = 0.023–0.079），表明存在设施特异性群落。培养分析在370份环境样本中的51份（13.8%）中检出Listeria spp.，主要来自排水沟（44/51，86.3%）。L. monocytogenes在六家设施中的五家被检出，21株分离株中有19株来自排水沟（90.5%）。对74株可分型的L. monocytogenes分离株进行MLST，显示出高度多样性，包含15个克隆复合体（clonal complexes，CCs）中的21个序列型（sequence types，STs），其中谱系II占主导（86.5%）。总体微生物群落组成与Listeria spp.及L. monocytogenes的存在显著相关（PERMANOVA，P = 0.001；R² = 0.0137和0.0083）。在排水沟中，归属于不动杆菌属（Acinetobacter）、Rhizorhapis属和漫游球菌属（Vagococcus）的扩增子序列变体（amplicon sequence variants，ASVs）与Listeria spp.阳性样本呈正相关。总之，这些发现表明排水沟是Listeria spp.的关键生态位，相关类群可能指示与Listeria spp.回收相关的排水沟群落。

单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性病原体，尽管经过常规清洁和消毒，仍可在肉类加工环境中持续存在。常驻微生物群落可能影响其存活，但将那些群落与基于培养的Listeria spp.检测联系起来的纵向研究仍然有限。本研究利用16S rRNA基因扩增子测序、基于培养的Listeria spp.检测以及L. monocytogenes分离株的MLST，对六家德国肉类加工设施一年内的微生物群落进行了表征。研究人员识别出设施特异性的微生物群落，确定地漏为Listeria spp.的关键生态位，并观察到不同设施内不同L. monocytogenes序列型的反复回收。在排水沟中，归属于Acinetobacter、Rhizorhapis和Vagococcus的ASVs与培养阳性样本正相关，确定了可能反映与Listeria spp.回收相关的微生物条件的候选类群。这些发现强调了不仅要考虑是否检出Listeria spp.，还要考虑可能支持其适应性的常驻微生物群落的重要性。

**论文解读：德国肉类加工设施微生物群落与李斯特菌属检出的关联**

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要的食源性病原体，可导致高住院率和死亡率的李斯特菌病，并在欧盟2024年主要人畜共患病报告中具有最高病死率。该菌能在食品加工环境中持久存在，常规清洁消毒难以彻底消除，其持久性不仅源于低温生长和生物膜形成等生理韧性，还可能受常驻微生物群落生态相互作用的影响。已有研究表明，假单胞菌等优势菌形成的生物膜可增强L. monocytogenes对消毒剂的抗性，而其他类群可能通过营养竞争或抑菌代谢物调节其存活。然而，肉类加工设施中微生物群落与李斯特菌检出之间的纵向关联仍缺乏系统研究。为此，研究人员对六家德国肉类加工设施开展为期一年的监测，结合16S rRNA V3/V4扩增子测序、培养检测和多位点序列分型（MLST），解析微生物群落结构、采样位点及Listeria spp.和L. monocytogenes检出之间的关联，以识别可能指示其持续存在的生态条件。

研究样本来自六家加工牛肉、猪肉或二者的设施，覆盖接收区、冷库、原料处理区和成品加工区，每设施设12–14个采样位点，每个位点采集相邻的两份拭子（共740个样本），分别用于测序和培养检测。测序数据经DADA2处理并基于SILVA v138.1数据库注释；Listeria spp.按ISO 11290-1进行富集培养，MALDI-TOF MS鉴定种；对L. monocytogenes分离株进行七管家基因MLST分型，其中包含设施提供的2020–2025年常规监测分离株。统计分析采用PERMANOVA评估群落差异，MaAsLin3识别差异丰度ASVs，同时分析Shannon多样性和纵向群落变化。

结果部分：
**对照表明测序性能可重复且污染低**。阴阳性对照显示标准菌群回收稳定，仅有少量低丰度污染序列，经decontam流程去除后不影响后续分析。
**不同设施的微生物群落共享Pseudomonas和Acinetobacter核心属**。366个有效样本的群落组成在设施间差异显著（两两PERMANOVA P=0.001），Pseudomonas和Acinetobacter在所有样本中超过90%检出且相对丰度≥0.0001，成为全数据集的唯二核心属，但不同设施还拥有各自特有的核心属，如F6含Psychrobacter、Kocuria等，提示设施内生态选择塑造了特异性菌群。
**微生物群落的时间动态**。Shannon多样性和纵向群落变化（以Aitchison距离衡量）均随采样事件显著变化，且生产区域影响群落更替幅度，但变化并非线性趋势，而是事件特异性的非线性波动，且不同设施间动态模式不一致，表明微生物群落的稳定性具有设施特异性。
**Listeria spp.和L. monocytogenes在地漏中的检出率显著高于食品接触表面**。370份样本中51份（13.8%）检出Listeria spp.，其中44份来自地漏（86.3%）；L. monocytogenes在五家设施中检出，21株中19株来自地漏。排水沟阳性率显著高于食品接触表面（44/180 vs 7/190，Fisher精确检验P=2.55×10^-9，OR=8.46），证实湿性难消毒生态位是李斯特菌的主要储库。
**Listeria spp.阳性与阴性样本的微生物群落组成存在显著差异，特定ASVs与阳性样本相关**。整体群落组成与Listeria spp.和L. monocytogenes检测状态显著相关（R²=0.0137和0.0083，P=0.001），但效应量较小。在地漏亚组中，Acinetobacter ASV167、Rhizorhapis ASV2147和Vagococcus ASV447的丰度与Listeria spp.阳性样本显著正相关（FDR q<0.1），而L. monocytogenes未发现显著关联ASV。
**MLST揭示高度遗传多样性和持续存在的序列型**。74株可分型L. monocytogenes以谱系II为主（86.5%），涵盖21个STs和15个CCs，最常见为ST9、ST37和ST451。部分ST在特定设施内长期重复检出，如ST9在F3检出17次，ST204在F2检出3次，ST87/ST121/ST451在F4反复出现，间隔超过6个月，符合持久性定义；而间隔较短则视为复发性检出。

讨论部分指出，Pseudomonas和Acinetobacter在肉类加工环境中的普遍优势可能与其嗜冷、表面附着和生物膜形成能力相关，而设施特异性核心属反映了原料、清洁效果等局部选择压力。属级核心稳定与ASV级更替并存，说明同一生态位可由不同菌株占据。地漏中阳性关联ASVs可能代表与李斯特菌共享湿性营养丰富生态位的类群，但尚不能确认为直接互作或生物标志物。MLST中谱系II和CC9、CC121、CC204等优势克隆复合体常见于食品加工环境，提示其适应清洁消毒压力和长期存活。

**研究结论**：总之，这项研究通过整合微生物群落谱、培养检测和MLST，对六家德国肉类加工设施中微生物群落结构和Listeria spp.出现提供了纵向视图。研究发现，应基于设施特异性常驻微生物群、湿且难以消毒的生态位（如地漏）、时间群落动态以及与Listeria spp.阳性样本相关的共现类群这一生态背景来解读Listeria spp.的回收。这种视角将环境中的Listeria spp.监测从存在/缺失检测转变过来，强调了考虑采样位点的微生物群落背景和生态位特征的重要性。虽然常规监测应继续优先考虑高风险位点如食品接触表面，但微生物组知情的方法可能通过帮助识别具有与L. monocytogenes生存或反复回收相关的微生物群落特征的环境生态位来提供补充信息。未来研究将纵向微生物群落谱与商业加工设施的常规环境和终产品监测相结合，可能有助于确定微生物组知情的方法是否为跟踪与Listeria spp.回收相关的微生物变化提供附加价值。相同L. monocytogenes ST的反复回收进一步支持了设施相关储库的相关性。与先前工作一致，本结果强调Listeria spp.监测应在每个设施更广泛的微生物生态学背景下解释。