宿主来源的刺激物改变铜绿假单胞菌细胞内钙水平，揭示其作为第二信使的潜在作用

《Applied and Environmental Microbiology》：Host-derived stimuli alter intracellular calcium levels in Pseudomonas aeruginosa, revealing its potential role as a second messenger

　　

钙信号（calcium signaling）是一种基本的细胞通讯机制，在真核生物中已得到充分确立，其依赖于钙离子（Ca²⁺）同时作为第一信使和第二信使来调节多种维持生命的过程。在细菌中，尽管Ca²⁺调节的重要性已被认识，但通常归因于其作为第一信使的作用，而其作为第二信使能力的机制基础仍然难以捉摸。此前，研究人员已表明，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种引起人类危及生命感染的机会性病原体，具备细胞内Ca²⁺（Ca²⁺_in）信号传导的关键先决条件，包括严格调控的Ca²⁺_in稳态、响应外源Ca²⁺时Ca²⁺_in水平的瞬时变化，以及Ca²⁺调控的基因表达。此外，研究人员和其他人鉴定出Ca²⁺信号网络的几个关键组分，包括Ca²⁺传感器、转运体和调节因子。剩余的问题是Ca²⁺_in水平是否响应Ca²⁺以外的任何细胞外刺激而改变。为确定这一点，研究人员使用了一种细胞质Ca²⁺探针R-GECO1，该探针产生Ca²⁺依赖性荧光，并测试了多种细胞外刺激，包括离子、单糖、氨基酸、核苷酸、群体感应信号分子、活性氧和抗生素。研究人员观察到响应于几种分子的Ca²⁺_in水平变化，特别是葡萄糖、天冬酰胺、ATP、ADP、AMP、HOCl和环丝氨酸。结果提供了首个实验证据，表明与真核生物一样，铜绿假单胞菌通过改变其Ca²⁺_in水平来响应特定的、化学多样性的宿主相关刺激，支持了Ca²⁺_in在细菌中潜在信号作用的观点。

重要性：细胞利用信号进行通讯并响应其环境。尽管钙离子（Ca²⁺）作为信号分子调节多种基本过程的作用已在真核生物中得到充分确立，但细菌中的Ca²⁺信号传导仍未得到充分研究。先前的研究已指出Ca²⁺在细菌调节中作为第一信使的作用；然而，其作为第二信使的作用尚未被认识。在此，研究人员首次表明，重要的人类病原体铜绿假单胞菌响应多种通常与宿主环境相关的外部刺激而改变其细胞内Ca²⁺水平。这些发现为铜绿假单胞菌利用Ca²⁺作为第二信使提供了机制基础。理解这些Ca²⁺响应为入侵病原体通过Ca²⁺介导的适应宿主环境提供了新的见解，并可能为开发新的抗菌策略提供信息。

论文解读：宿主来源刺激调控铜绿假单胞菌细胞内钙水平及其第二信使潜力

钙信号（calcium signaling）是细胞感知和响应环境的核心机制。在真核生物中，钙离子（Ca²⁺）既可作为第一信使传递细胞外信号，也可作为第二信使将胞外刺激转化为胞内反应，参与调控增殖、凋亡和免疫应答等过程。然而在细菌中，Ca²⁺虽被确认具有调节作用，但长期被视为第一信使，其作为第二信使的能力缺乏系统证据。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是引起人类急性或慢性呼吸道、伤口等感染的机会性病原体，尤其威胁囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者。先前研究表明，该菌具备细胞内Ca²⁺（Ca²⁺_in）信号的关键前提：严格调控的Ca²⁺_in稳态、外源Ca²⁺引起的瞬时Ca²⁺_in变化，以及Ca²⁺依赖的基因表达。然而，Ca²⁺_in是否响应除Ca²⁺以外的宿主相关刺激，仍悬而未决。该研究旨在回答这一问题。

研究人员构建了基于宽宿主载体pMF36的遗传编码钙指示剂（genetically encoded calcium indicator, GECI）R-GECO1表达质粒，并将其导入铜绿假单胞菌PAO1中，利用其荧光强度实时反映Ca²⁺_in水平。通过验证其对Ca²⁺的特异性、排除Mg²⁺干扰及pH影响，系统检测了离子、单糖、氨基酸、核苷酸、群体感应信号分子、活性氧和抗生素等刺激下的Ca²⁺_in动态。研究发现，葡萄糖、天冬酰胺、ATP、ADP、AMP、HOCl和环丝氨酸等能够显著改变Ca²⁺_in水平，首次提供了铜绿假单胞菌像真核生物一样通过Ca²⁺_in响应化学多样化宿主刺激的实验证据。该成果支持Ca²⁺_in在细菌中作为第二信使的潜力，为理解病原菌在宿主体内的适应性调控提供了新视角，也为新型抗菌策略的开发提供了理论依据。论文发表于《Applied and Environmental Microbiology》。

关键技术方法方面，研究人员使用R-GECO1作为Ca²⁺荧光探针，其包含钙调蛋白（calmodulin, CaM）结构域与环状排列红色荧光蛋白（cpRFP），结合Ca²⁺后荧光强度与Ca²⁺_in浓度成正比。为验证特异性，采用Mg²⁺刺激及钙离子载体calcimycin处理；为排除pH干扰，使用pH指示剂PHP监测细胞内pH，并选择稳定期细胞进行刺激实验。刺激物加入后，通过酶标仪记录荧光变化，数据经统计学分析。样本为实验室标准菌株PAO1，无临床队列。

研究结果分为以下几个部分。

**构建并评估用于监测铜绿假单胞菌Ca²⁺_in水平的R-GECO1和GCaMP6f指示剂**：通过将R-GECO1或GCaMP6f克隆至pMF36载体并在PAO1中表达，发现两种指示剂在添加5 mM Ca²⁺时荧光均显著增强，但R-GECO1因背景荧光较低而被选用。R-GECO1对10 μM至10 mM Ca²⁺_ex呈剂量依赖性响应，峰荧光随浓度增加而升高，EGTA可使其恢复至基线；Mg²⁺不引起荧光变化，calcimycin处理增强Ca²⁺响应，证实R-GECO1特异性报告Ca²⁺_in。

**铜绿假单胞菌的Ca²⁺_in稳态需要功能性Ca²⁺通道和ATP酶**：用钒酸盐（vanadate）抑制P型及ABC型ATP酶后，Ca²⁺_in在Ca²⁺刺激后无法回落至基线；用LaCl₃阻断Ca²⁺通道后，Ca²⁺摄取显著减少。这说明Ca²⁺外排和摄取分别由ATP酶和通道介导，维持Ca²⁺_in稳态。

**细胞内pH响应外源Ca²⁺**：使用PHP探针监测发现，预培养于5 mM Ca²⁺的对数中期细胞具有更高的细胞内pH（8.22），额外添加1 mM Ca²⁺后pH在10分钟内进一步升至9.54；而稳定期细胞pH较低（约7.03–6.82）且不响应Ca²⁺添加。为避免pH变化影响R-GECO1荧光，后续实验采用稳定期细胞。

**铜绿假单胞菌响应不同外部刺激改变Ca²⁺_in水平**：研究人员在含5 mM Ca²⁺的培养基中将PAO1培养至稳定期，分别施加各类刺激。

*离子（Ions）*：0.245 mM–200 mM NaCl不影响Ca²⁺_in，但1 M NaCl因引起渗透休克导致Ca²⁺_in升高；MgCl₂（≥100 μM）和FeSO₄（≥100 μM）剂量依赖性降低Ca²⁺_in，提示镁和铁可能激活Ca²⁺外排。

*糖类（Sugars）*：5和20 mM葡萄糖在4秒内引发Ca²⁺_in约两倍升高，20 mM时升高持续整个观察期；岩藻糖无显著效果，表明Ca²⁺_in可能参与感知葡萄糖供应的信号。

*氨基酸（Amino acids）*：精氨酸（Arg）仅在10 mM时引起约50%的短暂升高；天冬酰胺（Asn）效应最强，1和5 mM均使Ca²⁺_in升高约2.5倍；色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）分别引起短暂或适度的升高；谷氨酸无响应。在碱性pH（9）下，Arg和Asn诱导的Ca²⁺_in增加显著减弱，可能因碱性条件下氨基酸螯合Ca²⁺能力增强。

*核苷酸（Nucleotides）*：ATP、ADP、AMP（2.5–10 mM）均诱导双相反应：先快速升高Ca²⁺_in（ATP和ADP在5 mM最强，AMP在5–10 mM相似），随后下降至基线（AMP）或低于基线（高浓度ATP/ADP）。环二鸟苷酸（c-di-GMP，20 μM）轻微增加Ca²⁺_in，环腺苷酸（cAMP，30 μM）则略微降低。

*群体感应信号分子（Quorum-sensing signaling molecules）*：C4-HSL（1 μM）在90秒内将Ca²⁺_in降至基线，PQS（30 μM）使Ca

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