利用环介导等温扩增技术快速检测块菌及其外生菌根根尖中的栽培块菌属（Tuber）真菌

《Applied and Environmental Microbiology》：Rapid detection of cultivated truffle fungi (Tuber) from truffles and ectomycorrhizal root tips using loop-mediated isothermal amplification

　　

摘要

块菌属真菌（如黑孢块菌 *Tuber melanosporum* 和夏季块菌 *T. aestivum*）是珍贵的奢侈食品，历史上主要栽培于欧洲地中海地区。近年来块菌栽培技术的进步使得北美、南美、中国和澳大利亚等地建立了高产块菌果园。尽管取得了这些进展，一个持续存在的问题是非目标块菌物种的引入和意外栽培。非目标块菌物种（如 *T. indicum* 和 *T. brumale*）在形态上常与目标物种（如 *T. melanosporum*）相似，可能无意中被作为接种物引入并感染幼苗。检测接种物和幼苗污染十分困难，往往依赖于不可靠的形态学分析或劳动密集且耗时的PCR方法。此外，定量PCR（qPCR）检测仅针对 *T. melanosporum* 和 *T. aestivum* 开发，导致块菌种植者缺乏快速检测 *T. brumale* 等重要污染物种的工具。在本研究中，研究人员开发了一种快速的环介导等温扩增（LAMP）检测方法，用于检测三种全球栽培的块菌物种（*T. melanosporum*、*T. borchii* 和 *T. aestivum*）以及最常见的引入污染物种（*T. brumale*）。本文所展示的检测方法灵敏度至少可达10^-3 ng的DNA，且具有物种特异性。鉴于该方法所需时间短、灵敏度高、特异性强，且成本与PCR和qPCR方法相当，这些检测方法将引起块菌果园所有者和块菌检测机构的特别关注。

重要性

尽管块菌栽培在全球取得了成功，但意外栽培非目标块菌物种一直是一个持续存在的问题。为解决这一问题，研究人员开发了四种环介导等温扩增（LAMP）检测方法，用于从外生菌根根尖和块菌子实体中快速检测 *Tuber aestivum*、*T. borchii*、*T. brumale* 和 *T. melanosporum*。这些检测方法是广泛使用的 *T. aestivum* 和 *T. melanosporum* qPCR检测的替代方案，也是首个针对 *T. borchii* 和 *T. brumale* 的快速检测方法。

基于LAMP技术的栽培块菌快速检测方法研究解读

**一、研究背景与问题**

块菌属（*Tuber*）真菌是备受推崇的奢侈食品，每磅售价可达数百至数千美元。历史上，块菌仅在欧洲少数地中海地区栽培，但随着全球对块菌兴趣的增加和栽培方法的进步，澳大利亚、中国、新西兰、北美和南美等地已建立起高产果园。然而，全球块菌栽培的成功伴随着一个持续存在的严峻障碍：幼苗和接种物污染问题。竞争性外生菌根（ectomycorrhizal, ECM）真菌可抑制目标块菌物种对根系的成功菌根化，常见的温室污染物包括 *Pulvinula convexella* 和 *Sphaerosporella brunnea*。更为关键的是，接种物和接种幼苗可能被非目标块菌害虫物种（如 *Tuber brumale*）污染。*Tuber brumale* 原产于欧洲，全球许多果园从该地区获取块菌接种物。由于质量控制不严和检测要求宽松，*T. brumale* 已被意外引入澳大利亚、加拿大、新西兰以及最近的美国。尽管一些国家已建立幼苗和接种物的检测要求，但污染仍然存在，且新兴的北美块菌产业尚未建立相应检测标准。

检测接种物和幼苗污染是一项困难的任务，尤其对于块菌栽培新手而言。目前采用形态学和分子方法相结合的方式来验证接种效果、鉴定外生菌根形态类型并量化目标块菌物种的定殖程度。然而，仅基于形态特征的区分往往不可靠，因为孢子性状或ECM根尖形态的变异有限，且某些块菌外生菌根可能缺乏囊状体（cystidia），形态分型方法需要广泛的知识积累。基于ITS rDNA条形码的PCR或物种特异性序列的定量PCR（qPCR）是最可靠的技术，但这些方法通常不对公众开放，需要培训和专业实验室设备。虽然存在付费检测实验室，但服务可能过于昂贵且结果常需数周才能获得。此外，需要专用热循环仪的qPCR检测仅针对 *T. melanosporum* 和 *T. aestivum* 开发。因此，开发一种可及、廉价且快速的分子检测方法具有重要的实际意义。

**二、主要技术方法**

研究人员利用生物信息学方法从目标物种（*Tuber aestivum*、*T. borchii*、*T. brumale* 和 *T. melanosporum*）及外群物种（*Tuber magnatum*、*Tuber indicum* 和 *Sphaerosporella brunnea*）的基因组中鉴定独特标记区域，并通过BLAST搜索确保区域独特性后设计LAMP引物。LAMP检测使用四种至六种引物识别靶序列的多个区域，在等温条件下（65°C）进行扩增，通过颜色变化直观判断结果。研究中使用了CTAB法提取高质量DNA作为对照，同时验证了Tris-NaOH快速提取法和FTA卡（Flinders Technology Associates卡）两种简便DNA提取方法对LAMP反应的适用性。样本来源包括北美、中国和欧洲块菌果园采集的块菌子实体、日本森林采集的块菌、北美果园的ECM根尖以及北美和澳大利亚块菌果园的土壤。对照实验中，研究人员使用ITS区域测序和物种特异性qPCR确认样本中块菌物种身份。

**三、研究结果**

**独特标记区域的鉴定与LAMP引物设计**

研究人员从每个目标基因组中鉴定出大量独特序列区域：*T. aestivum* 40个、*T. borchii* 61个、*T. brumale* 37个、*T. melanosporum* 35个。其中能够设计包含环引物的完整LAMP引物组的分别有14个、17个、14个和5个序列。经过筛选，每个物种获得一套具有物种特异性、灵敏度达10^-3 ng DNA、能在30分钟内完成扩增并可从多个果园和标本中检测目标物种的引物组。

**LAMP检测的特异性、灵敏度与准确性**

每种LAMP检测方法对目标物种均表现出高特异性、灵敏度和准确性。*T. aestivum* 和 *T. brumale* 检测的特异性为0.96（95% CI: 0.82–0.99），灵敏度为1.00（95% CI: 0.78–1.00），准确性为0.95（95% CI: 0.85–0.99）；*T. borchii* 和 *T. melanosporum* 检测的特异性、灵敏度和准确性均为1.00。每种检测方法对来自不同提取方法的DNA浓度均具有灵敏度：CTAB法从干燥块菌中提取的DNA浓度为0.3–48 ng/μL，FTA卡法从ECM根尖和新鲜块菌中提取的DNA浓度为0.1–3 ng/μL，Tris-NaOH法从干燥块菌中提取的DNA浓度为3–7 ng/μL。在与30 ng非目标块菌DNA混合的反应中，各检测方法对低至10^-2 ng的目标DNA仍具有灵敏度。

**不同样本类型的检测效果**

每种LAMP检测方法均能可靠地检测从ECM根尖和块菌子实体中提取的DNA。然而，在土壤样本检测中，*T. borchii* 和 *T. aestivum* 在某些样本中未能被检测到，无论加入的DNA量（1–5 μL）或孵育时间（最长1小时）如何。*T. melanosporum* 检测方法表现更好，能在全部10个土壤DNA样本中持续检测到目标DNA。

**四、讨论与结论**

研究人员开发的检测方法存在一定局限性。*T. brumale* 引物仅针对在西欧最常见的A分支成员进行了验证，由于缺乏B分支标本和基因组数据，无法确定能否检测B分支成员。*T. aestivum* 引物能够检测长期存在争议的同物异名种 *T. uncinatum*，因为多项系统发育和溯祖分析已证明两者为同一物种，但尚未验证其是否能检测土耳其的潜在隐存种单倍型。土壤检测结果的不一致可能源于 *T. aestivum* 和 *T. borchii* 菌丝体在土壤中丰度较低，或存在影响LAMP反应的土壤抑制剂，因此不建议使用这些检测方法检测土壤中的块菌DNA。在检测过程中观察到的两次假阳性结果被归因于移液器造成的交叉污染，可通过使用带滤芯的移液器吸头、漂白剂清洁和dUTP/尿嘧啶-DNA糖基化酶系统来减少。

研究结论：研究人员开发了四种物种特异性的LAMP检测方法，用于从ECM根尖和块菌子实体中快速检测块菌属真菌。这些检测方法对块菌检测实验室和果园所有者尤其具有吸引力，因为其成本与传统PCR方法大致相当，但产生结果的速度显著更快。此外，研究人员为 *T. borchii* 和 *T. brumale* 这两种尚无qPCR检测方案的块菌物种开发了快速检测方法。当LAMP检测与Tris-NaOH快速提取法结合使用时，许多样本可在一小时内完成提取和检测。这些检测方法在块菌栽培中的示例用途包括：（i）确认用于接种物的块菌或块菌产品的物种身份；（ii）在种植前确定幼苗是否被正确的块菌物种菌根化；（iii）确定种植后1–2年块菌是否在ECM根上持续存在；以及（iv）从子实体或ECM根尖中检测污染物种 *Tuber brumale*。研究人员希望这些快速灵敏的检测方法能改善新兴块菌市场的质量控制，减少 *Tuber brumale* 和其他非目标物种向全球块菌果园的引入。该研究发表在《Applied and Environmental Microbiology》。