吲哚-3-羧酸通过抑制Netrin-1与UNC5B的结合促进结直肠癌细胞衰老

《Cellular Signalling》：Indole-3-carboxylic acid promotes senescence of colorectal cancer cells by inhibiting the binding of Netrin-1 to UNC5B

　　

摘要

背景

结直肠癌（CRC）的进展与异常细胞衰老相关。Netrin-1/UNC5B信号通路调控肿瘤细胞存活，但吲哚-3-羧酸（I3C）是否通过该通路调节CRC衰老尚不清楚。本研究旨在探讨I3C在CRC衰老中的机制及其与Netrin-1/UNC5B信号通路的关系。

方法

将HCT-116和HT29细胞暴露于I3C中。评估衰老程度，并验证I3C与UNC5B之间的靶向结合关系及关键结合位点。建立UNC5B敲低/突变细胞系；联合外源重组Netrin-1和Wnt/β-catenin抑制剂XAV939干预，阐明Netrin-1/UNC5B通路的下游机制。构建异种移植模型以验证I3C的抗肿瘤效应及分子靶点。

结果

I3C以浓度和时间依赖方式诱导CRC细胞衰老。I3C特异性结合UNC5B残基（SER604、THR590、GLU718），抑制Netrin-1/UNC5B相互作用，其中SER604被确定为功能性关键调控残基。值得注意的是，UNC5B功能缺失削弱了I3C的促衰老效应。Netrin-1/UNC5B信号可激活Wnt/β-catenin通路（上调Axin2、c-Myc、Cyclin D1），对抗多柔比星诱导的衰老，而XAV939逆转了这一激活。功能实验证实I3C以野生型UNC5B依赖方式促进衰老并抑制增殖、迁移和上皮-间质转化，主要通过SER604介导。外源重组Netrin-1可拮抗上述效应，而UNC5B敲低废除了这种拮抗作用。体内实验中，I3C依赖Netrin-1/UNC5B轴抑制肿瘤生长。

结论

I3C通过阻断Netrin-1/UNC5B结合促进CRC细胞衰老并抑制肿瘤进展，可能通过调节Wnt/β-catenin通路发挥作用。这揭示了I3C的一种新的抗癌机制及一个潜在的CRC治疗靶点。

引言

结直肠癌（CRC）是全球最常见的胃肠道恶性肿瘤之一。它在所有恶性肿瘤中发病率和死亡率均较高，对人类健康构成严重威胁[1]。尽管手术切除、化疗和靶向治疗等综合治疗模式持续进步，CRC患者的长期预后仍然不理想；化疗耐药、肿瘤复发和转移仍是临床管理的主要瓶颈[2]、[3]。新兴证据揭示了驱动CRC的多种分子异常，例如致癌性环状RNA hsa_circ_0005939通过miR-4693-3p/UHRF1BP1L轴促进肿瘤进展[4]；microRNA miR-1204通过直接靶向MASPIN促进细胞增殖和迁移[5]；驱动蛋白家族成员KIF20A通过c-Myc/HIF-1α信号通路促进Warburg效应和转移[6]。这些发现凸显了CRC发病机制的多面性。因此，深入探索CRC发生和进展的分子机制，以及鉴定安全高效的天然生物活性化合物和潜在治疗靶点，对于提高CRC的诊断和治疗疗效具有重要意义。

近年来，诱导肿瘤细胞衰老作为一种新兴治疗策略受到了广泛关注[7]。细胞衰老是指细胞在应激条件下启动的不可逆生长停滞程序，其核心特征包括衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增加、衰老相关蛋白p16和p21水平升高、衰老相关分泌表型（SASP）因子分泌增加，并伴随细胞周期紊乱[8]、[9]。研究表明，干预细胞衰老过程可能为CRC治疗提供新思路；例如，USP14/S100A11轴[10]和METTL3/CDKN2B通路[11]已被证实参与调控CRC细胞衰老。多柔比星（Dox）等化疗药物通过诱导肿瘤细胞衰老发挥抗肿瘤作用，但肿瘤细胞常通过激活促存活信号通路来对抗衰老过程，导致化疗效果降低[12]、[13]，而控制这一过程的精确分子机制尚不完全清楚。同时，小分子化合物也作为抗CRC药物被积极研究；例如，PF-04449913已被证明通过抑制ERK/p65通路并下调MMP9表达来抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭[14]。这表明靶向关键信号通路的新化合物可能带来治疗优势，而天然产物是此类候选物的重要来源。因此，揭示肿瘤细胞抵抗衰老的分子机制并鉴定能够增强化疗诱导衰老的化合物，对于提高CRC治疗具有重要意义。

吲哚-3-羧酸（I3C）是一种源自色氨酸的植物代谢物[15]、[16]。凭借其良好的安全性和生物相容性，其抗癌潜力已引起广泛关注[17]、[18]。值得注意的是，新兴证据已确立天然和微生物代谢物可通过调节关键信号通路发挥抗肿瘤作用。例如，肠道微生物来源的代谢物苯乙酰谷氨酰胺已被证明通过抑制Wnt/β-catenin信号来抑制肿瘤进展[19]，而植物多糖当归多糖（ASP）通过miR-3187-3p/PCDH10介导的抑制相同通路来抑制癌细胞的恶性行为[20]。这些发现支持了天然化合物——尤其是属于吲哚类膳食代谢物的I3C——可能通过Wnt/β-catenin通路调节发挥抗癌作用的观点。近期研究表明，I3C可通过调节Rorγt/IL-22通路改善肠屏障功能[21]，并通过抑制AHR通路影响T细胞分化以增强抗肿瘤免疫[22]。这些发现揭示I3C在CRC中发挥重要的调控功能。然而，其在调控CRC细胞衰老方面的具体作用及分子靶点仍不清楚。

近年来，Netrin-1及其受体UNC5B在肿瘤生物学中的功能已引起广泛关注。Netrin-1是一种分泌蛋白，最初参与神经发育和轴突导向[23]。在肿瘤细胞中，Netrin-1与受体UNC5B结合激活下游信号，从而调控细胞存活、增殖和迁移[24]、[25]。在CRC中，Netrin-1/UNC5B信号轴已被证实可促进细胞存活和转移[26]、[27]。进一步研究表明，Netrin-1与UNC5B结合可通过激活Wnt/β-catenin信号改善血脑屏障缺陷[28]。阻断核β-catenin信号可干扰Cyclin D1和c-Myc的转录，从而诱导CRC细胞衰老[29]。值得注意的是，Netrin-1参与调控骨髓微环境中的细胞衰老[30]。此外，多柔比星和5-氟尿嘧啶等化疗药物可在肿瘤细胞中诱导p53依赖性Netrin-1上调；这种上调作为一种促存活机制削弱了化疗诱导的细胞死亡[31]，提示Netrin-1/UNC5B信号可能参与调控肿瘤细胞衰老。然而，Netrin-1/UNC5B轴与Wnt/β-catenin通路在调控CRC细胞衰老中的机制仍有待进一步验证。

基于上述背景，我们提出科学假说：I3C可能通过阻断Netrin-1与UNC5B的结合来抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而诱导CRC细胞衰老并进一步抑制肿瘤进展。为此，本研究旨在采用多柔比星诱导的细胞衰老模型和体内裸鼠肿瘤异种移植模型，系统研究I3C对CRC细胞的诱导衰老效应，验证I3C与UNC5B之间的靶向结合关系及关键位点，并阐明Netrin-1/UNC5B-Wnt/β-catenin通路在I3C调控CRC细胞衰老中的分子机制。本研究有望为基于天然化合物的CRC靶向治疗提供新的理论基础和潜在方法。

部分摘要

细胞培养与处理

人CRC细胞系HCT-116（AW-CCH026，Abiowell）和HT29（AW-CCH054，Abiowell）在含10% FBS（10,099,141，Gibco）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（AWH0529a，Abiowell）的McCoy's 5 A培养基（iCell-0011，Icell）中，于37 °C、5% CO?恒温恒湿培养箱中培养。进行I3C（HY-40161，MCE）浓度梯度实验（0、1.25、2.5、5 μM[22]，48 h）和时间梯度实验（0、12、24、48 h，5 μM），以阐明

I3C诱导CRC细胞衰老

为探索I3C对CRC细胞的促衰老作用并阐明相关分子机制，将HCT-116和HT29细胞系暴露于不同浓度的I3C中不同时间段。通过SA-β-Gal染色实验定量细胞衰老程度。染色结果表明，在两种细胞系中，SA-β-Gal阳性衰老细胞比例随I3C浓度递增而逐步增加（范围从0到1.25，

讨论

本研究利用体外实验模型和体内裸鼠异种移植实验，系统揭示了I3C调控CRC衰老和肿瘤进展的分子机制。已确认I3C可靶向结合UNC5B，抑制Netrin-1与UNC5B的相互作用，阻断下游Wnt/β-catenin信号通路的激活，最终诱导CRC细胞衰老并抑制细胞增殖、迁移及体内肿瘤生长。这

CRediT作者贡献声明

Yao Zhou：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，可视化，监督，项目管理，调查研究，基金获取，形式分析，数据管理，概念化。Qingping Luo：可视化，验证，调查研究，数据管理。Wei Peng：验证，调查研究，数据管理。Yuhang Hu：验证，调查研究，数据管理。Yi Tang：撰写—审阅与编辑，资源。

伦理审批

所有动物实验程序均经长沙社会工作学院医学院医学伦理委员会审查批准（批准编号：202418）。

基金资助

本研究受湖南省自然科学基金项目资助（编号：2025JJ80357）。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

Yao Zhou|Qingping Luo|Wei Peng|Yuhang Hu|Yi Tang

长沙社会工作学院医学院，中国长沙