人羊膜脱细胞化两种方法的评估及其在组织工程中的应用

《Methods and Protocols》：Evaluation of Two Methods for Decellularizing Human Amniotic Membranes for Use in Tissue Engineering

　　

背景：人羊膜（human amniotic membrane, hAM）因低免疫原性及富含结构蛋白的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）而广泛用于组织工程；脱细胞化旨在去除细胞成分同时保留组织完整性。本研究比较两种酶法（胰蛋白酶与嗜热菌蛋白酶）的效果。方法：取自胎盘的人羊膜分为三组：非脱细胞对照组、胰蛋白酶处理组与嗜热菌蛋白酶处理组。膜以0.25%胰蛋白酶-EDTA于37 °C处理60 min，继以Triton X-100于37 °C孵育30 min；或以125 μg/mL嗜热菌蛋白酶于37 °C处理9 min。苏木精-伊红（hematoxylin–eosin, H&E）组织学分析及半定量评分评估上皮与间质完整性，免疫组化以定量图像分析评价层粘连蛋白α（laminin α）与纤连蛋白（fibronectin）表达，单轴拉伸试验测量力学特性；未报告预注册号或动物模型。结果：胰蛋白酶上皮去除更有效，嗜热菌蛋白酶致更大间质破坏；各组间层粘连蛋白α或纤连蛋白表达无统计学差异（p > 0.05），表明关键ECM成分得以保留；两处理均降低机械性能，嗜热菌蛋白酶降低早中期刚度，胰蛋白酶降低后期应力与功密度。结论：两种酶法均保留ECM组成但引起不同结构与力学改变，方法选择应依预期应用平衡高效去细胞与结构功能属性保留。

研究背景与立项依据

人羊膜（hAM）为胎囊最内层，由上皮层、间质层及基底膜构成，富含有胶原、层粘连蛋白（laminin）与纤连蛋白（fibronectin），因低免疫原性、抗微生物及促上皮化等特性近百年被用于外科重建与再生医学。脱细胞化（decellularization）旨在消除细胞相关免疫原性同时保留ECM三维架构与生化信号，是hAM作为组织工程支架前处理的核心步骤。现有物理、化学与生物（酶法）方案各异，最优协议需在彻底去细胞与最小ECM扰动间权衡，但胰蛋白酶（trypsin，丝氨酸蛋白酶）与嗜热菌蛋白酶（thermolysin，金属蛋白酶）两类酶法对hAM分区损伤及力学后果的直接比较数据不足。研究人员因此开展对照研究，评价两法对hAM上皮/间质完整性、基底膜蛋白保留及单轴力学性能的差异化影响，论文发表于《Methods and Protocols》。

主要关键技术方法

研究人员从哥伦比亚Zipaquirá Hospital Universitario La Samaritana择期剖宫产健康产妇获取13例胎盘（伦理批号11-2020），按本国Resolution 5108 of 2005组织库规范筛选供体（排除感染、高危性行为等），胎盘以含青霉素-链霉素-两性霉素B冷盐水转运，实验室分离hAM平铺硝化纤维素纸、DMEM-甘油1:1于?20 °C冻存。脱细胞分组：胰蛋白酶组以0.25% trypsin-EDTA 37 °C 60 min后Triton X-100 37 °C 30 min；嗜热菌蛋白酶组以125 μg/mL thermolysin 37 °C 9 min；均血清终止并PBS洗涤。评价技术含H&E半定量上皮/间质完整性评分（Wagner量表）、层粘连蛋白α与纤连蛋白免疫组化（DAB显色，ImageJ算积分光密度IOD）、以及行为对齐（onset→UTS）单轴拉伸（Instron 3900，3 mm/min，排列置换检验与Hedges’ g效应量）。

研究结果

3.1 脱细胞hAM的组织学表征

H&E显示胰蛋白酶组上皮完整性评分中位数3.00（完全脱落倾向），嗜热菌蛋白酶组2.84，对照组0.17，组间Kruskal–Wallis p=0.035但Bonferroni校正后两两不显著；间质评分胰蛋白酶0.50、嗜热菌蛋白酶1.00、对照0.00（p=0.087）。描述上胰蛋白酶上皮去除更强，嗜热菌蛋白酶间质破坏更重。免疫组化IOD分析示纤连蛋白（对照34.9×10⁶、胰蛋白酶36.9×10⁶、嗜热菌蛋白酶35.1×10⁶）与层粘连蛋白α（对照37.35×10⁶、胰蛋白酶37.32×10⁶、嗜热菌蛋白酶37.46×10⁶）组间p均>0.05，证实两酶法保留基底膜关键ECM蛋白。

3.2 脱细胞hAM的力学响应

行为对齐应力-应变曲线示原生hAM最高抗载，嗜热菌蛋白酶组早中期切线模量ξ=0.05处降至0.69±0.66 MPa（对照2.63±1.84，p=0.070，g=?1.41），中期割线模量ξ=0.50为1.14±1.07 MPa（对照1.91±1.26）；胰蛋白酶组早期刚度近似对照（2.59±2.70 MPa，p=0.967）但后期ξ=0.75应力0.099±0.089 MPa（对照0.243±0.168，g=?1.03）、功密度0.0121±0.0164 MPa（对照0.0382±0.0105，g=?1.54）显著降低。两法均致软化，但嗜热菌蛋白酶偏早中期刚度损失，胰蛋白酶偏后期抗载与吸能损失。

3.3 行为对齐均值曲线（onset→UTS）

归一化曲线印证上述分区：对照全程最高，嗜热菌蛋白酶中间轨迹伴晚期抬升，胰蛋白酶多数段最低。有用延伸率ε′_UTS对照0.305±0.078、胰蛋白酶0.258±0.195、嗜热菌蛋白酶0.193±0.056，后者变形区间最短。

讨论与结论翻译

讨论指出胰蛋白酶作丝氨酸蛋白酶靶向细胞黏附蛋白、利于上皮脱离而对ECM攻击弱；嗜热菌蛋白酶作金属蛋白酶水解疏水残基、偏好降解胶原相关结构蛋白致间质碎裂。两法皆保留laminin α/fibronectin，但引发“上皮去除效率—间质完整”权衡。力学软化与组织学模式自洽：嗜热菌蛋白酶破坏胶原网致早中期刚度降，胰蛋白酶保间质早刚但矩阵重排损后期吸能。作者明示局限为对照n=3、序数评分主观、单轴测试缺黏弹性，需扩大队列与体内再细胞化验证。

结论部分译文：本研究证明胰蛋白酶与嗜热菌蛋白酶酶法脱细胞均保留hAM之ECM组成（尤其laminin与fibronectin），支持其作组织工程生物支架；胰蛋白酶上皮去除更高效，嗜热菌蛋白酶间质改变更剧；两法均较原生组织降低机械性能——嗜热菌蛋白酶主降早中期刚度，胰蛋白酶主降后期阻力与功密度；故无普适最优协议，方法遴选应依预期应用平衡高效去细胞与结构功能保留；多维度（组织学、生化、力学）评价有助于理性设计可重复生物材料。