《Current Opinion in Structural Biology》：Integrating
in situ single-particle cryo-electron microscopy with cryo-electron tomography for high-resolution structural biology in native cellular contexts
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单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）通过实现对纯化的大分子复合体原子分辨率结构测定，彻底改变了结构生物学领域。近年来，原位单颗粒冷冻电子显微镜的进展将这一能力扩展至在天然细胞环境内直接进行近原子级结构分析。然而，由于许多细胞内靶标丰度低、结构异质性强且难以检测，仍存在重大挑
单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）通过实现对纯化的大分子复合体原子分辨率结构测定，彻底改变了结构生物学领域。近年来，原位单颗粒冷冻电子显微镜的进展将这一能力扩展至在天然细胞环境内直接进行近原子级结构分析。然而，由于许多细胞内靶标丰度低、结构异质性强且难以检测，仍存在重大挑战。与此同时，冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结合子断层平均技术，能够在保留三维细胞环境背景的前提下实现对大分子复合体的原位可视化，但有限通量和分辨率制约了对稀有或异质复合体的高分辨率分析。在本综述中，我们讨论了样本制备、数据采集、图像处理和高精化方面近期的进展，这些进展提高了原位结构生物学的通量、灵敏度和分辨率。我们进一步强调了如何将原位单颗粒冷冻电子显微镜与cryo-ET相结合，在细胞可视化与近原子级结构测定之间架起桥梁，为在天然细胞环境内直接研究动态大分子复合体提供了一种可扩展的框架。
引言
理解大分子复合体如何在天然细胞环境中发挥功能，一直是结构生物学的核心目标之一 [1,2]。单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）通过实现对难以通过X射线晶体学方法研究的纯化大分子复合体的原子结构测定，彻底改变了这一领域。近年来，原位结构生物学的进展使得在天然薄片细胞样本或冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削的细胞样本中直接测定大分子复合体的近原子结构成为可能 [1,3, 4, 5]。然而，许多天然大分子复合体数量稀少、结构异质性高、瞬时组装，并嵌入拥挤的细胞环境中，这对高分辨率原位单颗粒冷冻电子显微镜构成了重大挑战 [1,2]。与此同时，冷冻电子断层扫描（cryo-ET）已成为一种强大的原位细胞样本成像技术。结合子断层平均技术，cryo-ET能够在其天然细胞环境中对大分子复合体进行结构分析，分辨率通常可达纳米至亚纳米级别 [6, 7, 8]。
原位单颗粒冷冻电子显微镜和cryo-ET面临的一个主要挑战是如何从天然细胞环境中获取足够数量的颗粒以确定高分辨率原位结构。瓶颈并不在于任何单一实验步骤，而在于从样本制备和数据采集到颗粒检测和图像处理整个工作流的效率。在本综述中，我们讨论了样本制备、数据采集、颗粒识别和高精化方面的最新进展，并强调了cryo-ET与原位单颗粒冷冻电子显微镜的整合如何实现大分子复合体在天然细胞环境内的可扩展结构表征。
章节摘要
天然薄片样本与微创分离
广泛的天然薄片样本，包括包膜病毒 [9]、薄壁细菌 [8,10] 和分离的细胞器 [11]，可以直接成像，无需冷冻-FIB铣削（图1a）。对于这些样本，优化样本浓度和冰层厚度对于最大限度地提高在天然细胞环境中颗粒的可见性至关重要。
另一种策略是微创分离，在不破坏目标物天然组织的情况下富集目标分子。示例包括
冷冻电子断层扫描的数据采集
传统的"剂量对称倾斜方案"采集一组倾斜序列约需45分钟，将每天的断层图像数据集限制为仅数十组 [32]。基于预校准的方法，如FastTomo [33]，将预测性离焦校正整合到SerialEM工作流程中，在优化条件下可将采集速度提高至每天约150–200组倾斜序列 [8]。采用束-像位移的并行化多倾斜序列采集技术，如PACE-tomo和SPACE-tomo，进一步提高了
颗粒检测的进展
由于原位大分子复合体通常数量稀少并嵌入拥挤的细胞环境中，准确高效的颗粒检测仍然是一个重大挑战。尽管手动挑选对于视觉上易于区分的靶标仍然可靠，但它耗时费力、主观性强，且难以扩展至高分辨率结构测定所需的颗粒数量。一系列基于深度学习的颗粒挑选工具，包括TomoTwin [41]、DeepETPicker [42]、MiLoPYP [43] 以及
冷冻电子断层扫描与原位单颗粒冷冻电子显微镜的整合
鉴于cryo-ET和原位单颗粒cryo-EM为细胞内大分子复合体提供了互补的视图，二者的整合为理解细胞中许多重要但稀有且动态的复合体的结构和功能提供了独特的机会（图1）。Cryo-ET是识别天然环境中大分子复合体的首选方法，可绘制其空间组织图谱并捕获多种功能状态，分辨率通常可达纳米至亚纳米级别
IV型分泌系统
军团菌（Legionella pneumophila）的Dot/Icm IV型分泌系统（T4SS）提供了一个令人信服的例子，说明了如何将cryo-ET和原位单颗粒cryo-EM整合以在天然细胞环境中研究一种大型细菌纳米机器。Dot/Icm T4SS以将超过300种效应蛋白转位至宿主细胞中引起感染而闻名（图2）。早期的cryo-ET研究在细菌极点识别出4–6个Dot/Icm T4SS [50,51]，并揭示了其整体架构，
展望：高通量原位结构生物学
原位结构生物学已成为一种强大的方法，可直接在天然细胞环境中测定大分子复合体的结构。尽管取得了显著进展，但仍面临一个主要挑战：目标分子稀少、异质性高，并嵌入拥挤的细胞环境中。若干技术进步可能会推动该领域的下一阶段发展。首先，通过人工智能引导的自动化技术贯穿整个工作流程——从样本制备到数据
致谢
J.Y.、W.G. 和 J.L. 得到美国国立卫生研究院（NIH）的资助项目R01AI087946、R01GM110243、R01AI132818、R01AI15242、R01AI172097 和 R01AI198530 的支持。我们感谢 Jennifer Aronson 对本文的审读。
Jian Yue | Wangbiao Guo | Jun Liu
耶鲁大学医学院微生物致病学系，美国康涅狄格州纽黑文市，邮编06516
