螺旋藻来源的食品级藻蓝蛋白延长秀丽隐杆线虫寿命并促进脂质代谢转录重塑

《Food Bioscience》：Food-Derived Phycocyanin from Spirulina Promotes Longevity and Lipid-Metabolic Transcriptional Remodeling in Caenorhabditis elegans

　　

摘要

藻蓝蛋白（PC）是螺旋藻中的一种主要藻胆蛋白，是一种具有抗氧化特性的食品来源生物活性化合物，但其对生物体寿命及相关代谢反应的影响尚未完全阐明。本研究在秀丽隐杆线虫中利用蛋白质表征、无细胞自由基清除实验、寿命分析、转录组学、独立qRT-PCR验证、细胞内氧化敏感性荧光检测、细菌生长对照实验以及中性脂质染色，对一种纯化PC制剂进行了系统研究。SDS-PAGE显示两条主要条带，与藻蓝蛋白预期的α亚基和β亚基一致。PC表现出浓度依赖性的DPPH和ABTS自由基清除活性，并以非线性剂量-反应模式延长线虫寿命，其中3 mg/mL在20 °C和25 °C下均产生最大效应。在从发育期到成虫期的持续暴露条件下进行RNA-seq，鉴定出883个差异表达基因。在与寿命实验匹配的条件下，qRT-PCR独立验证了fat-5上调和acdh-1、acdh-2及vit-2下调。3 mg/mL PC处理还使细胞内DCF荧光降低约32.6%，并使全身相对油红O染色增加约38%。重要的是，3 mg/mL PC对大肠杆菌OP50的整体生长或活菌密度未产生可检测的影响。综上所述，这些结果表明，PC相关的寿命延长伴随着线虫中可重复的脂质代谢相关转录变化、中性脂质染色改变以及细胞内氧化敏感性荧光降低。建立这些反应之间的因果关系，还需要进行遗传学、脂质组学以及额外的宿主-微生物相关研究。

引言

衰老是一种普遍存在的生物学现象，伴随着生理完整性的进行性丧失，导致功能受损并增加死亡易感性（López-Otín等，2013）。这种退化是人类主要病理状况的主要风险因素，包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病（Niccoli和Partridge，2012）。氧化应激衰老理论认为，活性氧（ROS）的积累会损伤细胞大分子，从而加速衰老及相关功能失调（Sohal等，2002）。因此，鉴定能够清除ROS并调节衰老相关信号通路的天然生物活性化合物，已成为营养保健品研究的焦点（Ding等，2017）。

螺旋藻（钝螺旋藻）是一种微观丝状蓝细菌，因其丰富的营养组成和促进健康的特性而被广泛作为功能性食品食用（Bortolini等，2022）。在其生物活性成分中，藻蓝蛋白（C-PC）作为一种水溶性藻胆蛋白，因其抗氧化、抗炎和神经保护等多种生物活性而引起了广泛关注（Fernández-Rojas等，2014；Romay等，2003）。既往研究表明，C-PC可在体外和体内清除自由基并抑制脂质过氧化（Bhat和Madyastha，2000）。此外，据报道C-PC可通过调节抗氧化酶对与氧化应激相关的疾病（如缺血性卒中和多发性硬化症）产生治疗效果（Pentón-Rol等，2016；Marín-Prida等，2013）。尽管这些发现前景可观，但藻蓝蛋白影响生物体寿命的具体分子机制，尤其是其对全局基因表达和代谢调节的作用，仍未完全阐明。

线虫秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫）是一种成熟的衰老研究模式生物，具有寿命短、遗传背景清晰以及人类疾病相关通路高度保守等特点（Kaletta和Hengartner，2006）。大约60–80%的秀丽隐杆线虫基因具有可识别的人类同源基因，使该生物体成为筛选生物活性化合物和研究寿命调节相关分子过程的有用实验系统（Markaki和Tavernarakis，2020）。多个保守的信号和代谢网络参与线虫的长寿调节，包括胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路（IIS）、涉及DAF-16/FOXO等转录调节因子的应激反应通路，以及与脂质代谢相关的通路（Kenyon，2010）。这些相互关联的过程体现了寿命调节的复杂性，并提示食品来源的生物活性化合物可能引发协调性的分子反应，而非通过单一信号通路发挥作用。因此，转录组学分析提供了一种有用的系统水平方法，用于识别此类协调反应并生成机制假说，而无需预设特定的长寿通路。然而，秀丽隐杆线虫对藻蓝蛋白暴露的转录组水平反应及其与观察到的长寿表型之间的关系，仍未得到充分表征。

在本研究中，我们采用综合食品生物科学方法，在秀丽隐杆线虫中表征了纯化螺旋藻来源PC制剂的生物学反应。我们将蛋白质水平表征和无细胞自由基清除实验与寿命分析、高通量转录组学、独立的寿命匹配qRT-PCR验证、细胞内氧化敏感性荧光测量、细菌生长和活性对照实验以及全身中性脂质染色相结合。RNA-seq用于在从发育期到成虫期持续暴露条件下识别PC响应性转录特征，而选定的分子和生理反应则在更紧密匹配寿命实验的条件下进行了独立考察。通过整合这些互补方法，我们旨在确定PC相关的寿命延长是否伴随着可重复的脂质代谢相关和氧化还原相关反应，同时将实验支持的关联性区别于需要进一步验证的因果关系。

各章节摘要

材料与试剂

螺旋藻（钝螺旋藻）菌株BCRC AL20145购自台湾新竹生物科技资源研究中心（BCRC）。该菌株在Zarrouk培养基中于25 °C下培养，并以冷白色LED灯提供约200 μmol photons m^-2 s^-1强度的持续光照以促进藻胆蛋白积累。2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）和5-氟-2'-脱氧尿苷

纯化藻蓝蛋白制剂的表征及其抗氧化相关性质

采用SDS-PAGE对生物实验所用纯化PC制剂进行额外的蛋白质水平表征。与粗制CaCl₂冻融提取物相比，最终经切向流过滤纯化并冻干的PC制剂显示出明显简化的蛋白质谱。在约17–18和19–20 kDa处观察到两条主要条带，分别与藻蓝蛋白α亚基和β亚基的预期分子量一致（图1A）。结合上述结果

藻蓝蛋白以非线性剂量-反应模式延长寿命

本研究证明，补充纯化螺旋藻来源藻蓝蛋白（PC）制剂可在标准条件（20 °C）和高温条件（25 °C）下延长野生型N2秀丽隐杆线虫的寿命。在所测试的浓度中，3 mg/mL PC始终产生最大的寿命延长效果，在20 °C下平均寿命延长约26.3%，在25 °C下延长约41.7%。5 mg/mL保留了较小但具有统计学意义的益处，而10 mg/mL

结论

本研究证明，纯化螺旋藻来源藻蓝蛋白制剂在实验条件下可延长秀丽隐杆线虫的寿命，其中3 mg/mL在非线性剂量-反应模式中产生最大效应。除浓度依赖性的无细胞自由基清除活性外，在与寿命实验匹配的条件下，PC处理与细胞内DCF荧光降低约32.6%相关。

在……条件下进行的RNA-seq

CRediT作者贡献声明

西川义一：撰写——审阅与编辑、验证、方法学。黄翔如：撰写——初稿、方法学、调查、形式化分析、数据整理。田中宏：撰写——审阅与编辑、方法学。杨玖恩：撰写——审阅与编辑、验证、资源、方法学。廖建森：撰写——审阅与编辑、指导、项目管理、资金获取、概念化。赖志仁：调查、形式化分析、数据整理

数据可用性

RNA-seq数据将在出版前存入公共数据库。其他支持性数据可从通讯作者处通过合理请求获得。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。Colame Cosmetics Co., Ltd.提供了分析程序方面的技术指导，但未参与研究设计、数据解释、稿件撰写或决定投稿发表。

资金支持

本工作由树德科技大学 [ISU-111-02-01A] 及台湾地区国家科学技术委员会 [科技部 115-2515-S-214-004] 资助。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的经济利益/个人关系：廖建森报告称，树德科技大学医学院提供了行政管理支持、文章出版费用、设备、药物或耗材、统计分析以及写作协助。如有其他作者，他们声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢Colame Cosmetics Co., Ltd.为本研究中的分析方法及实验程序提供技术指导。

黄翔如|西川义一|杨玖恩|田中宏|赖志仁|廖建森

台湾中山大学药物生物科学研究所，高雄市804201，台湾