超声触发壳聚糖界面交联构建核壳纳米乳剂以增强红景天苷生物可及性

《Food Chemistry: X》：Ultrasound-triggered chitosan interfacial crosslinking for core–shell nanoemulsions with enhanced salidroside bioaccessibility

　　

**摘要**：研究人员开发了一种超声驱动策略，用于在卵磷脂稳定的纳米乳剂表面构建壳聚糖-三聚磷酸盐离子交联壳层，以增强红景天苷的包封效果。超声加速了磷酸盐向壳聚糖吸附层的质量传递，使交联密度均匀化，将交联度提高至0.78，并形成了致密的界面凝胶网络，最高包封效率达69.21%。纳米乳剂由黏性流体转变为黏弹性弱水胶体，弛豫时间分布收窄。磷酸盐与壳聚糖羟基/氨基之间形成了氢键与离子键的耦合作用，同时¹H NMR证实了油分子运动受限及C2H化学位移向低场移动，表明存在–NH₃⁺/磷酸根离子对的形成。体外模拟消化实验表明，红景天苷具有较高的生物可及性（25%），并促进了混合胶束的形成；消化后胶束显著减轻了缺氧诱导的RAW264.7巨噬细胞氧化损伤，降低了ROS/NO水平，恢复了ATP生成，并下调了HIF-1α信号通路。上述发现确立了超声驱动的界面离子交联作为一种有效策略，可用于构建稳健的核壳纳米乳剂，以增强食品成分的生物活性。

**论文解读文章**

**一、研究背景与科学问题**

红景天苷（salidroside）是一种具有显著抗氧化、抗炎及线粒体保护功能的生物活性化合物，能够稳定缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）并上调血管内皮生长因子表达，从而增强细胞在低氧条件下的生存能力。然而，红景天苷的强亲水性阻碍其有效穿越细胞膜脂双层屏障，同时其在胃肠道中易受pH波动和酶解影响，导致口服生物利用度极低。纳米乳剂（nanoemulsion）作为多相胶体分散体系，具有良好的生物相容性和增溶能力，是口服营养素递送的理想载体。然而，传统乳剂在胃肠道（gastrointestinal tract, GIT）环境中结构脆弱，胆汁盐对乳化剂的置换、胰脂肪酶对磷脂的酶解以及离子强度的剧烈变化均易破坏界面完整性，引发液滴聚结和活性物质提前释放。壳聚糖（chitosan）作为一种阳离子多糖，可通过静电锚定吸附于油-水界面，其丰富的氨基基团可与多价阴离子发生离子交联，形成致密的三维聚合物网络壳层，从而增强液滴的力学鲁棒性。然而，传统静态界面交联受限于弯曲液滴界面处交联剂的不均匀扩散，常导致壳层厚度不均及机械稳定性欠佳。超声作为一种非热物理加工手段，其空化效应可显著加速交联剂向壳聚糖吸附层的质量传递，促进离子交联网络的均匀致密化。尽管超声辅助界面交联已用于增强微胶囊和纳米颗粒的结构稳定性，但其在构建壳聚糖基核壳纳米乳剂以实现红景天苷高效口服递送方面的应用仍未见报道。因此，本研究旨在利用超声驱动策略，在液滴界面构建致密的壳聚糖-磷酸盐交联壳层，系统考察所得核壳纳米乳剂的理化性质、界面交联机制、体外消化命运及细胞保护功效。

**二、主要技术方法**

研究人员以20%中链甘油三酯（medium-chain triglyceride, MCT）为油相，红景天苷溶于pH 7.0磷酸盐缓冲液（3 mg/mL），2%卵磷脂为稳定剂，经高压均质制备基础纳米乳剂。随后将乳剂加入壳聚糖溶液（1%, w/v, pH 5.0）中，调节pH至5.0后逐步加入磷酸盐溶液（100 mM, pH 7.0），磷酸盐总量分别为壳聚糖的1/10（低）或1/5（高），随后在300 W、20 kHz、30%振幅条件下超声处理15 min，设置对照组（无壳聚糖）、壳聚糖组（CH）、低/高磷酸盐交联组（L-CH-TSP/H-CH-TSP）及相应超声组（L-CH-TSP-UL/H-CH-TSP-UL）。研究采用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）测定液滴尺寸、ζ-电位（zeta potential）及多分散指数（polydispersity index, PDI）；采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）法测定交联度；采用超滤离心结合高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）测定包封效率与载药量；利用激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）观察界面形貌；采用旋转流变仪测定流变学特性；利用拉曼光谱和¹H NMR阐明分子间相互作用。此外，系统评价了乳剂在pH、离子强度、酶及储存条件下的环境稳定性，并利用体外模拟胃肠道消化模型监测液滴尺寸、ζ-电位和微观结构变化。消化后的胶束相用于Caco-2细胞单层转运实验评估生物利用度，并应用于CoCl₂诱导的缺氧损伤RAW264.7巨噬细胞模型以评价细胞保护效果。

**三、研究结果**

**3.1 超声驱动界面交联的机制**：研究结果表明，超声诱导的空化效应促进了纳米乳剂液滴的细化和界面组分的均匀重排，增加了油-水界面面积，为壳聚糖与磷酸盐之间的多重相互作用提供了更多结合位点。随后，壳聚糖与磷酸盐通过离子相互作用、氢键和配位作用协同组装，在纳米乳剂界面形成致密的黏弹性凝胶层，构建了稳定的核壳结构，增强了界面屏障性能。该界面网络不仅提高了红景天苷在纳米乳剂体系中的稳定保留能力，还通过调控分子扩散过程实现了缓释效果。

**3.2 纳米乳剂的理化性质**：对照组平均液滴尺寸为5.42 nm，ζ-电位为0.44 mV。壳聚糖吸附使液滴尺寸增至30.81 nm，ζ-电位升至19.03 mV，证实了质子化氨基在液滴表面的静电锚定。TSP引入后液滴尺寸呈剂量依赖性增加（L-CH-TSP为33.40 nm，H-CH-TSP为36.39 nm）。超声显著减小了液滴尺寸（p < 0.05），并将ζ-电位恢复至18.43-21.33 mV，PDI降至0.45，表明超声促进了磷酸盐在界面层的快速均匀扩散，使交联密度均质化而非单纯增加壳层厚度。CLSM图像显示，超声减弱了液滴桥连絮凝，形成了更均匀的界面网络分布。

**3.3 红景天苷负载与释放能力**：对照组因缺少壳聚糖无法形成交联网络，包封效率（encapsulation efficiency, EE）最低。壳聚糖的引入将包封效率与载药量分别提高至约59.34%和1.95%。TSP交联后，L-CH-TSP和H-CH-TSP组的包封效率分别提高至64.28%和69.21%，载药量达2.51%和2.99%。超声处理组实现最高包封效率与载药量，归因于超声诱导的液滴细化与界面致密化的协同效应。释放动力学结果显示，H-CH-TSP-UL组360 min累计释放率最低（25.18%），具有最显著的缓释特征。超声处理对释放行为的影响与交联度密切相关：在低交联度下超声不显著改变整体释放水平，而在高磷酸盐条件下，超声促进了壳聚糖-三聚磷酸盐交联网络的均匀形成，形成了更致密稳定的界面屏障。

**3.4 纳米乳剂的流变特性**：所有组均呈现剪切变稀行为。壳聚糖的引入增加了体系黏度，但物理缠结网络在高剪切速率下易解体。TSP交联组在整个剪切速率范围内维持较高黏度，H-CH-TSP组在低剪切区黏度最高但结构异质性影响其完整性。频率扫描表明，L-CH-TSP组在中低频区出现G′与G″的交叉，指示弱凝胶网络的形成。Cole-Cole图显示，交联组在G′高值区出现拖尾和非对称延伸，表明交联网络引入了从分子链段运动到整体网络重排的宽弛豫时间谱。超声处理后的H-CH-TSP-UL组Cole-Cole图明显收窄，弛豫时间分布变窄，网络结构更加均匀。Han图进一步表明，H-CH-TSP-UL组在所有含壳聚糖配方中线性分布最佳、离散度最小，具有更均匀的黏弹性结构。

**3.5 纳米乳剂中的分子相互作用**：拉曼光谱显示，H-CH-TSP-UL组MCT油的CH₂弯曲振动（1452 cm^-1）显著增强并峰形锐化，表明紧密包裹的壳聚糖-磷酸盐壳层限制了酰基链的无序热运动。约1062 cm^-1处归属于壳聚糖C–O–C糖苷键伸缩振动与磷酸盐ν3不对称伸缩振动的重叠信号发生蓝移且半峰宽增大，证实磷酸盐与壳聚糖羟基/氨基之间形成了氢键与离子键的耦合作用。¹H NMR分析表明，壳聚糖-磷酸盐壳层对油滴的紧密包裹严重阻碍了界面及近界面区域MCT分子的各向同性快速旋转。C2H峰（3.6 ppm）在TSP加入后向低场移动，表明–NH₂质子化为–NH₃⁺并与磷酸根形成离子对。MCT的sn-1,3甘油骨架质子化学位移保持稳定，证明壳聚糖网络主要锚定于油-水界面，未与油相核心发生显著的分子间相互作用。

**3.6 纳米乳剂的环境胁迫稳定性**：pH稳定性实验显示，TSP交联组在pH 3.0时因–NH₃⁺过度质子化产生分子内静电排斥，网络紧密度受到破坏，液滴显著增大；在中性至弱碱性条件下维持稳定尺寸。离子强度实验中，H-CH-TSP-UL组在100-300 mM NaCl范围内无显著尺寸变化（p > 0.05），表明经超声优化的高密度交联网络在静电排斥被屏蔽时仍可通过物理缠结和位阻效应维持结构完整性。酶稳定性方面，胃蛋白酶处理下H-CH-TSP和L-CH-TSP-UL组表现出尺寸减小，胰蛋白酶处理后所有组均出现尺寸增大，但交联组的变化幅度较小。储存稳定性实验中，L-CH-TSP、H-CH-TSP和H-CH-TSP-UL组在60天储存期内尺寸无显著变化，证实致密交联网络有效抑制了奥斯特瓦尔德熟化（Ostwald ripening）。

**3.7 体外模拟胃肠道消化**：在胃消化阶段，所有组液滴尺寸均显著增大，但超声处理组（L-CH-TSP-UL和H-CH-TSP-UL）无显著差异且比其他含壳聚糖组更稳定，表明高交联密度在胃环境中限制了溶胀行为并保持了结构完整性。肠消化阶段，界面保护不足的组出现明显相分离。ζ-电位监测显示，胃阶段含壳聚糖乳剂的电位接近0 mV，但未引发严重絮凝，表明超声优化的致密交联网络主要通过空间位阻而非静电排斥稳定液滴。肠阶段所有组转为负电位，胆汁盐吸附和游离脂肪酸电离主导了界面电荷特征。

**3.8 红景天苷的生物可及性与生物利用度**：体内模拟消化结果表明，对照组生物可及性最低。壳聚糖物理吸附层提供了一定的空间位阻，但屏障效应相对松散。TSP交联组生物可及性显著提高（p < 0.05），超声优化组（L-CH-TSP-UL和H-CH-TSP-UL）达到最佳生物可及性（25%），且两者间无显著差异（p > 0.05）。Caco-2细胞单层转运实验显示，H-CH-TSP-UL组的跨膜转运效率略低，这可能归因于过度致密的交联网络在一定程度上限制了红景天苷在肠道环境中的释放。

**3.9 红景天苷胶束对RAW264.7细胞缺氧损伤的改善作用**：所有含红景天苷的组均维持了极高的细胞活性（>95%），证实消化后胶束具有良好的生物相容性。超声优化组，特别是H-CH-TSP-UL组，显著降低了缺氧诱导的细胞内ROS和NO水平（p < 0.05）。丙二醛（malondialdehyde, MDA）梯度降低，在H-CH-TSP-UL组达到最低值，表明高交联密度结合超声均质化作用最大限度地保护了红景天苷免于消化环境降解。H-CH-TSP-UL组SOD活性显著降低但并非抗氧化能力减弱的体现，而是红景天苷直接清除ROS、减轻细胞应激并恢复代谢稳态的结果。H-CH-TSP-UL组ATP水平显著高于其他组，表明该递送系统在保护线粒体功能和维持缺氧条件下细胞能量供应方面发挥关键作用。在分子信号层面，H-CH-TSP-UL组显著下调HIF-1α水平，并伴随其下游效应因子促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）和内皮素-1（endothelin-1, ET-1）的降低，表明红景天苷通过改善线粒体呼吸效率和氧气利用效率从根本上缓解了细胞缺氧感知。

**四、结论**

本研究成功建立了基于超声驱动界面离子交联的核壳纳米乳剂非热加工策略。H-CH-TSP-UL纳米乳剂实现了0.78的交联度、69.21%的包封效率及最缓慢的累计释放曲线，同时表现出优异的pH、离子强度、酶解和长期储存稳定性。体外模拟胃肠道消化证实，超声优化的交联网络实现了25%的红景天苷生物可及性并促进了可生物利用混合胶束的形成。释放的红景天苷负载胶束显著减轻了RAW264.7巨噬细胞中缺氧诱导的氧化应激，下调了HIF-1α信号通路并恢复了受损的线粒体能量代谢。该策略不仅适用于红景天苷这类热敏性活性成分的稳定包封，还有望拓展至多种天然生物活性化合物的口服递送系统，为提高其生物利用度和生物活性提供了新的技术途径。