尺寸可控的乳清蛋白微凝胶实现低油Pickering乳液的凝胶化可调控性：颗粒尺寸与浓度作用机制

《Food Hydrocolloids》：Size-Controlled Whey Protein Microgels Enable Tunable Gelation in Low-Oil Pickering Emulsions: Role of Particle Size and Concentration

　　

摘要
尽管已有许多配方被开发用于稳定低油Pickering乳液，但如何通过颗粒设计实现从可流动乳液到乳液凝胶的转变仍然是一个挑战。本研究通过低能耗的蛋白质-多糖相分离途径，利用水包水（W/W）乳液制备了尺寸可调、亚微米级球形乳清蛋白微凝胶（WPMs）。获得了平均尺寸约为200 nm、500 nm和1 μm的微凝胶，并评估了其作为低油Pickering体系结构构建单元的潜力。当WPM浓度为4.5 wt%时，所有WPM稳定的低油乳液在28天储存期间均表现出极小或无明显分层现象。然而，其流变行为强烈依赖于微凝胶尺寸。WPM～1 μm形成了具有凝胶特征的高黏度结构化乳液，而WPM～200 nm则产生了具有更高流动性的可流动乳液。这些体系的稳定性和结构化由WPMs在油-水界面和体相中的耦合贡献共同决定。较大尺寸的WPMs（尤其是WPM～1 μm）表现出较低的静电排斥力和更具黏弹性的界面膜。同时，它们在连续相中的聚集促进了颗粒桥接和渗流网络的形成，从而驱动体系向Pickering乳液凝胶转变，并显著增强了体系黏弹性。这些结果表明，WPM尺寸调控界面稳定化和体相网络形成，为将低油Pickering体系从可流动乳液调控为稠厚的凝胶状乳液提供了实用途径。

**尺寸可控乳清蛋白微凝胶调控低油Pickering乳液凝胶化：颗粒尺寸与浓度的作用机制——论文解读**

**1. 研究背景与问题提出**

在食品工业中，水包油（O/W）乳液通常依赖食品级乳化剂（如蛋白质、磷脂、表面活性剂和多糖）进行稳定，这些乳化剂通过降低界面张力并在油-水界面形成吸附层来防止液滴聚集。然而，近年来研究发现，传统小分子表面活性剂可能对人体健康产生潜在不利影响，这促使研究者将目光转向由固体颗粒稳定的Pickering乳液。Pickering乳液凭借其良好的生物相容性、环境友好性和界面可调性而受到广泛关注。乳液凝胶作为一种具有黏弹性的胶体材料，相较于传统乳液表现出更强的物理稳定性和更优的流变可调性。然而，以往关于Pickering乳液向Pickering乳液凝胶转变的研究主要集中在高内相乳液（内部相体积分数φ≥74%），其作为脂肪替代品时受限于过高的含油量，难以应用于低脂食品配方，且高黏弹性限制了流变调制的空间。相比之下，低内相Pickering乳液（φ<0.4）因液滴堆积分数低、颗粒介导网络弱，通常呈现低黏度和高流动性，易发生重力分离和液滴粗化，其稳定性面临严峻挑战。因此，亟需开发兼具有效乳化功能和营养价值的食品级颗粒，并使其在低油体系中具备诱导乳液凝胶化的能力。微凝胶作为兼具聚合物和颗粒特性的胶体实体，为实现Pickering乳液向凝胶态的转变提供了重要契机，但如何在精确控制颗粒尺寸和界面性质的同时降低能耗、减少溶剂或添加剂使用，并实现可规模化生产，仍是关键挑战。基于此，研究人员提出假设：乳清蛋白微凝胶（WPM）的尺寸可通过颗粒扩散、表面电荷、水化作用、界面积累、颗粒层粗糙度、液滴桥接和体相微凝胶网络化等多重耦合效应调控低油乳液的凝胶化行为。

**2. 研究内容与意义**

本研究采用改进的相分离策略，通过调节蛋白质与多糖的比例，制备了平均粒径分别约为200 nm、500 nm和1 μm的三种亚微米级球形乳清蛋白微凝胶，分别记为WPM～200 nm、WPM～500 nm和WPM～1 μm。研究人员进一步制备了由不同尺寸微凝胶稳定的低油（φ=0.1）O/W乳液，系统考察了微凝胶颗粒尺寸、浓度及其组合对乳液稳定性和流变性质的调控作用。结果表明，在4.5 wt%微凝胶浓度下，所有WPM稳定的低油乳液在28天储存期内均表现出优异的分层稳定性，但流变行为呈现显著的尺寸依赖性。WPM～1 μm形成具有凝胶特征的高黏度结构化乳液，而WPM～200 nm则产生流动性更强的乳液。这一差异源于较大微凝胶较低的静电排斥力、更具黏弹性的界面膜，以及其在连续相中聚集所诱导的颗粒桥接和渗流网络形成。该研究揭示了WPM尺寸通过耦合调控界面稳定化和体相网络形成来驱动低油Pickering体系从可流动乳液向凝胶状乳液转变的机制，为设计具有定制流动特性的低脂乳液提供了理论基础。该成果发表于《Food Hydrocolloids》。

**3. 主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：（1）利用乳清蛋白分离蛋白（WPI）与海藻酸钠在水相中的静电排斥驱动的相分离行为，通过水包水（W/W）乳液结合热处理诱导蛋白质网络形成，制备尺寸可控的微凝胶；（2）采用动态光散射（DLS）和Zeta电位分析表征微凝胶的流体动力学直径、粒径分布及表面电荷；（3）采用扫描电子显微镜（SEM）和光学显微镜观察微凝胶形态；（4）采用悬滴法测定油-水界面张力和表观接触角；（5）采用激光衍射粒度分析仪测定乳液液滴尺寸分布，结合1% SDS分散比较计算絮凝指数（FI%）；（6）采用界面剪切流变学测量表征微凝胶界面膜的黏弹性；（7）采用稳态剪切和动态振荡剪切流变学测量表征乳液的流动行为和黏弹性质；（8）采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可视化微凝胶在界面和体相的分布；（9）以商业蛋黄酱为基础基质进行应用验证。微凝胶的制备基于研究人员前期建立的方法（Chu, Jo, et al., 2022），WPI（95.0%总蛋白）由Agropur Ingredients（美国）提供，海藻酸钠购自Thermo Fisher Scientific（美国）。

**4. 研究结果**

**4.1 乳清蛋白微凝胶（WPMs）的特性表征**

通过WPI与海藻酸钠混合溶液的相分离及后续热处理，成功制备了WPM～1 μm、WPM～500 nm和WPM～200 nm三种微凝胶。在pH 6条件下，WPI（ζ电位：-22.1 mV）和海藻酸钠（ζ电位：-58.03 mV）均携带负电荷，两者因静电排斥和水亲和力差异而自发发生相分离。热处理促使蛋白质分子展开，暴露疏水结构域和巯基，通过二硫键和疏水相互作用形成三维交联网络，从而固定微凝胶结构。随着海藻酸钠比例增加，连续相黏度增大，延缓了蛋白质富集液滴的扩散和聚结，导致微凝胶尺寸减小。DLS分析显示三种微凝胶具有较窄的粒径分布（PDI值较低）。Zeta电位测量表明，WPM～200 nm的绝对表面电荷最高（-48.56 mV），而WPM～500 nm和WPM～1 μm的净电荷较低，这归因于海藻酸钠在微凝胶表面形成阴离子多糖壳层。接触角测量显示，所有WPM样品的θ值接近90°，表明具有适中的油水润湿性，其中WPM～1 μm的接触角为105.2±1.82°，而WPM～200 nm为89.1±1.47°。

**4.2 WPM乳液的共聚焦显微镜分析（CLSM）**

CLSM成像揭示了不同尺寸微凝胶在低油（φ=0.1）乳液中的分布差异。所有微凝胶均围绕分散油滴形成特征性的Pickering型界面层。较大的微凝胶（WPM～1 μm）吸附后呈现明显更粗糙的界面轮廓，且在连续相或液滴表面可观察到微凝胶聚集和液滴间桥接现象。相比之下，WPM～200 nm稳定的乳液液滴尺寸更小，液滴间桥接作用较弱。这些观察提示亚微米级微凝胶在界面和体相中扮演着不同的角色。

**4.3 WPMs的界面性质**

**4.3.1 润湿性**

所有WPM样品均表现出接近90°的油水接触角，表明其具有适中的润湿性。WPM～1 μm的接触角最大（105.2°），而WPM～200 nm最小（89.1°）。较小的接触角可能与海藻酸钠在微凝胶表面的富集程度较高有关，增加了表面亲水性和水化层稳定性。较大的微凝胶则暴露出更多来自乳清蛋白的疏水结构域，导致接触角增大。

**4.3.2 界面吸附行为**

界面张力测量表明，所有微凝胶均能在油-水界面自发吸附，但吸附动力学呈现尺寸依赖性。在初始吸附阶段（1–60 s），WPM～200 nm的界面张力始终高于WPM～500 nm和WPM～1 μm，这可归因于其较高的绝对ζ电位（-48.57 mV）所产生的更强静电吸附能垒，降低了吸附速率。WPM～1 μm达到界面张力平衡所需的时间更长，表明其在界面上的变形和重构是相对缓慢的过程。总体而言，WPMs经历的界面结构变形和/或重构程度低于天然WPI，且随着粒径增大，这种差异更加显著。

**4.3.3 界面流变学**

界面剪切流变学测量显示，所有样品的界面储能模量（GS'）均高于界面损耗模量（GS''），表明形成了以弹性为主的界面层。其中WPM～1 μm表现出最高的界面储能模量，其次是WPM～500 nm，而WPM～200 nm与WPI相当且略低。频率扫描进一步证实，WPM～1 μm和WPM～500 nm形成的界面为更强、以弹性为主的凝胶状界面层。微凝胶在界面上的协同吸附和堆积可通过颗粒间缔合增强界面膜强度，且可能形成超越简单单层的微凝胶网络。

**4.4 WPMs稳定的低油乳液性能评价：颗粒浓度依赖性**

**4.4.1 乳液外观与储存稳定性**

当微凝胶浓度低于4.5%时，所有粒径的WPM稳定乳液均在3小时内发生相分离。当微凝胶浓度达到4.5%时，所有乳液均保持稳定。EWPM～1 μm-4.5%在整个28天储存期内保持宏观均质，无相分离现象；WPM～500 nm和WPM～200 nm体系在第7天出现轻微分层（CI=0.1），但后续保持基本不变。值得注意的是，在4.5%浓度下，三种粒径制备的乳液表现出目视可辨的黏度差异：EWPM～1 μm-4.5%的黏度最高，类似希腊酸奶质地；而EWPM～200 nm-4.5%具有良好的流动性和明显较低的黏度。

**4.4.2 液滴尺寸分析与微观结构**

在微凝胶浓度为0.15%时，不同WPM稳定的乳液均表现出较大的液滴尺寸。WPM～1 μm产生相对较大且部分非球形的液滴，这可能源于不完全且空间不均匀的界面覆盖以及较大微凝胶的局部堵塞效应。随着微凝胶浓度增加，WPM～500 nm和WPM～200 nm稳定的乳液液滴尺寸显著减小，而WPM～1 μm体系的液滴尺寸变化不明显。在SDS分散条件下，WPM～200 nm稳定的乳液平均单液滴直径始终显著小于WPM～1 μm和WPM～500 nm体系。总体而言，较小尺寸的WPM颗粒有利于形成更细小的单个液滴。

**4.4.3 絮凝指数（FI）分析**

在低微凝胶浓度（<4.5%）下，所有体系均表现出部分絮凝，这归因于颗粒供给不足迫使液滴共享吸附颗粒。WPM～200 nm稳定的乳液相比WPM～500 nm体系表现出更高的抗絮凝能力。随着微凝胶浓度增加，所有体系的FI%逐渐趋近于零。值得注意的是，EWPM～1 μm-4.5%在FI=0时仍保持高黏度，表明SDS无法拆解连续相中支撑高黏度的微凝胶网络。基于不同尺寸微凝胶的界面和电荷特性，研究人员提出：WPM～1 μm体系可能通过较厚的弹性界面层满足降低絮凝的条件，而WPM～200 nm体系则通过较高的静电排斥力实现抗絮凝。

**4.5 从流体状乳液到低油Pickering乳液凝胶的尺寸依赖性流变转变**

**4.5.1 表观黏度与流动行为**

稳态剪切测试显示，所有乳液均表现出显著的剪切变稀行为。EWPM～1 μm-4.5%的黏度最高，其次为EWPM～500 nm-4.5%和EWPM～200 nm-4.5%。在50 s^-1剪切速率下，EWPM～1 μm-4.5%的表观黏度达到0.79±0.07 Pa·s，显著高于已报道的SPI纳米颗粒稳定乳液体系。Herschel-Bulkley模型拟合显示，EWPM～1 μm-4.5%具有最高的屈服应力（31.63±1.85 Pa），EWPM～200 nm-4.5%最低（0.33±0.09 Pa）。较大微凝胶更易促进液滴间桥接，相邻液滴上的颗粒层可发生机械互锁或弱吸引相互作用，形成承力三维结构，从而显著提高体系低剪切黏度并产生表观屈服应力。

**4.5.2 频率扫描**

振荡频率扫描表明，所有乳液的G′均高于G″，呈弹性主导特征。EWPM～1 μm-4.5%在全部频率范围内表现出最高的G′且频率依赖性较小，表明形成了具有明显屈服应力承载结构的低油Pickering乳液凝胶。EWPM～500 nm-4.5%呈现弱凝胶特征但网络较弱。EWPM～200 nm-4.5%则表现为稳定但流体状的弱结构化Pickering乳液，在高频区G″显著增加，表明其内部结构在振荡变形下更易重组。损耗因子tan δ方面，EWPM～1 μm-4.5%和EWPM～500 nm-4.5%体系的tan δ在整个频率范围内保持在1以下，呈弹性主导的凝胶状结构特征；而EWPM～200 nm-4.5%的tan δ明显较高，且随频率增加而增大，在高频区接近甚至超过1，表明黏性贡献显著增强。

**4.6 WPMs的表面负载量**

表面负载量测定显示，WPM～1 μm和WPM～500 nm稳定的乳液蛋白质表面负载量（158±6.13 mg/m²和153±4.5 mg/m²）显著高于WPM～200 nm体系（89±1.9 mg/m²）。较大的微凝胶通过颗粒间缔合促进协同吸附和积累，形成更富蛋白的界面层，这也与其界面膜的强化一致。相比之下，WPM～200 nm虽然形成更细小的液滴，但界面蛋白质负载量更低。

**4.7 乳液形成机制**

综合上述分析，研究人员提出了尺寸依赖的微凝胶低油乳液形成机制。在油-水界面，WPM～1 μm表现出更强的亲油性（θ=105.2°），WPM～200 nm更接近中性润湿（θ=89.1°），WPM～500 nm介于两者之间。WPM～1 μm和WPM～500 nm形成的界面为更强、以弹性为主的凝胶状界面层。同时，WPM～1 μm分散体本身的体相黏度显著高于其他微凝胶分散体。界面和体相网络的协同作用共同增强了EWPM～1 μm-4.5%体系的稳定性：界面聚集、液滴桥接和体相网络化共同驱动了乳液凝胶转变，结合液滴-微凝胶拥挤效应促进渗流网络形成，从而增加G′和屈服应力，抑制液滴迁移和重力分离。

**4.8 基于蛋黄酱基质的应用验证**

将EWPM～1 μm-4.5%以40 wt%的比例掺入商业蛋黄酱中，所得配方（WPM-M）在50 s^-1下的表观黏度达1.93 Pa·s，显著高于对应的WPI-M配方（0.09 Pa·s）。WPM-M在整个测试频率范围内保持弹性主导响应（G′>G″），tan δ保持在相对较低水平且低于1，其数值接近商业蛋黄酱（CM），表明在复杂食品基质中仍保持强烈的结构化能力。14天冷藏储存期间WPM-M无可见相分离，证明了WPM结构化低油乳液在实际食品配方中的流变支撑功能。

**5. 总结讨论与研究结论**

本研究通过相分离策略开发了三种具有不同颗粒尺寸的亚微米乳清蛋白微凝胶，实现了低油水包油Pickering体系黏度的可调构建，涵盖稳定的可流动乳液和结构化的凝胶状乳液。通过解析微凝胶在界面和体相中的贡献，揭示了稳定化机制：在三种粒径中，较大微凝胶（WPM～1 μm）通过在体系内诱导网络化结构而促进凝胶化，该结构通过微凝胶网络形成、液滴聚集和堵塞效应限制了液滴的迁移性。基于与最小微凝胶稳定乳液的比较，可推断体相微凝胶网络是凝胶化的重要贡献因素，而较小微凝胶较强的静电排斥力可能导致了其较弱的体相缔合。同时，吸附的WPMs形成黏弹性的微凝胶负载界面层，对液滴完整性做出贡献。界面效应和连续相效应并非独立运作，其耦合强度取决于微凝胶尺寸（决定扩散和吸附动力学、界面堆积几何和液滴桥接）、表面化学和电荷（控制润湿性和静电排斥）以及浓度（影响体相聚集倾向）。因此，此类微凝胶的开发为调控低油Pickering乳液凝胶、推动体系从流体状向结构化承力状态转变提供了机制基础。所开发的自聚集微凝胶在需要定制质地和黏度的低脂食品中具有广阔的应用前景，未来研究可聚焦于：确定最能预测低油条件下抗聚结和液滴缔合能力的界面结构描述符；阐明体相微凝胶自诱导结构化形成渗流网络的条件及其与界面堆积和液滴拥挤的耦合机制，从而建立基于微凝胶的Pickering乳液预测性设计规则，以平衡稳定性、质地和加工性能。