《Food Chemistry: X》：Peroxyl radical-mediated oxidative crosslinking of faba and pea proteins: Differential aggregation behavior and implications for protein structuring
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蚕豆和豌豆蛋白在植物基食品系统中越来越多地被用作替代蛋白；然而，目前对它们受过氧自由基（ROO•）氧化的相对敏感性仍知之甚少。本研究旨在利用由AAPH（2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐）热解产生的ROO•，比较蚕豆和豌豆蛋白单独及混合时的氧化行为，以阐
蚕豆和豌豆蛋白在植物基食品系统中越来越多地被用作替代蛋白；然而，目前对它们受过氧自由基（ROO•）氧化的相对敏感性仍知之甚少。本研究旨在利用由AAPH（2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐）热解产生的ROO•，比较蚕豆和豌豆蛋白单独及混合时的氧化行为，以阐明蛋白质组成如何影响氧化模式。氧化诱导产生了相似水平的氢过氧化物和羰基化合物，且二级结构未发生重大变化。然而，与豌豆蛋白相比，蚕豆蛋白表现出更高程度的高分子质量聚集体的形成。在蚕豆蛋白中，交联物质与双酪氨酸和双色氨酸的形成有关，主要涉及legumin-α（α-豆球蛋白）；而豌豆蛋白中的氧化主要与~47 kDa的vicilin（豌豆球蛋白）组分的修饰有关。这些发现表明，蚕豆和豌豆蛋白在氧化诱导的交联行为上存在显著差异，突出了蛋白质组成在调节植物基蛋白系统氧化结构变化中的作用。
研究背景、问题与意义
随着人口增长、可持续饮食需求增加以及对肉类生产环境影响的担忧加剧，替代蛋白质来源受到广泛关注。其中，植物源蛋白，特别是豆类蛋白，已成为开发肉类类似物的前景原料。然而，在实现理想的质地、营养品质和消费者接受度方面仍存在重大挑战。蛋白质氧化因能够促进共价交联、聚集和网络形成，被认为是植物蛋白系统结构发展的关键因素。在食品加工过程如高水分挤压（HME）中，蛋白质常暴露于有利于结构和氧化反应的条件，但加工条件的复杂性使得难以分离氧化反应对蛋白质结构修饰的具体贡献。此外，脂质氧化衍生的ROO•在含蛋白质基质中作为相关氧化物质已被识别，其会靶向半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸和蛋氨酸等易感氨基酸，导致氧化产物和共价二聚体的形成。蚕豆蛋白（FP）和豌豆蛋白（PP）是技术相关的豆类蛋白成分，两者在主要球蛋白组分分布上存在差异，FP富含legumin-α，而PP富含~47 kDa vicilin。目前尚不清楚这种蛋白质组成的差异如何影响其氧化敏感性和共价交联形成，尤其是在混合系统中FP与PP的相互作用是否会产生可预测的聚集模式尚属未知。为填补这一空白，研究人员假设ROO•介导的氧化会在FP和PP中引发不同的共价聚集途径，且混合系统会表现出独特的氧化行为。本研究深入探讨了豆类蛋白氧化和交联的机制，对理解植物蛋白系统氧化结构变化具有重要意义，相关成果已发表在《Food Chemistry: X》上。
关键技术方法
研究人员使用Saporiti Chile Ltda.提供的商业蛋白分离物开展研究。主要技术方法包括：评估在不同破坏性试剂下蛋白质的溶解度；利用AAPH热解产生的ROO•对单独及混合的FP与PP进行控制氧化；采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析分子质量分布；利用场发射扫描电子显微镜（FESEM）观察微观结构；通过圆二色性（CD）光谱以及色氨酸和1-苯胺基-8-磺酸萘（ANS）荧光评估蛋白质构象变化；使用亚铁氧化-二甲酚橙（FOX）法和2,4-二硝基苯肼（DNPH）法分别测定氢过氧化物和羰基含量；借助液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析特定氨基酸氧化产物；并利用PyMOL软件分析legumin-α的三维结构。
研究结果
FP和PP在磷酸缓冲液中的溶解度
研究人员通过在不同破坏性条件下评估FP、PP及其混合物的溶解度发现，这些蛋白在磷酸缓冲液中的平均溶解度极低（约5.6%），表明主要以聚集体形式存在。加入十二烷基硫酸钠（SDS）和尿素（U）后溶解度显著增加至约66.5%，加入二硫苏糖醇（DTT）时约为28.1%，三者联用时近乎完全溶解（约100%）。这表明非共价相互作用（特别是疏水作用和氢键）是稳定这些聚集体的主要力量，而二硫键的贡献较小。此外，在U和DTT存在下，PP的溶解度低于FP，表明FP中氢键和二硫键的贡献更大。
SDS-PAGE和FESEM研究
通过SDS-PAGE分析发现，FP中最丰富的蛋白为~38 kDa的legumin-α，而PP中主要为~47 kDa的vicilin。经ROO•（每分钟产生8 μM）氧化后，FP样品中legumin-α条带减弱，并伴随不可还原的高分子质量聚集体（HMMA）的大量形成；而PP中仅~47 kDa vicilin条带轻微减弱，HMMA形成极少。非还原电泳表明未氧化的FP中存在二硫键交联的HMMA，氧化后FP的HMMA显著增加，表明氧化不仅促进了二硫键形成，还产生了不可还原的共价加合物。FESEM结果证实，氧化后FP形成了更互连的网络状形态，而PP呈现更不规则的形态。混合物的行为介于两者之间，未显示出显著的FP-PP混合交联。
ROO•对FP和PP构象的影响
通过CD光谱分析发现，FP和PP具有豆类球蛋白典型的二级结构（β-结构占主导），且氧化未引起二级结构的重大变化，表明HMMA的形成并非由广泛的蛋白解折叠驱动。Trp荧光在氧化后大幅降低，表明ROO•诱导了Trp残基的实质性氧化，且这些残基在天然状态下即可被氧化剂触及。ANS荧光显示FP比PP具有更高的表面疏水性，且氧化后FP和PP的荧光强度分别降低29.0%和15.4%，这可能是由于蛋白质聚集掩盖了疏水位点，暗示三级结构仅有轻微变化，但这些修饰可能影响蛋白质-蛋白质相互作用及结构形成。
AAPH衍生的ROO•在FP和PP中产生的氧化产物
通过FOX和DNPH测定显示，FP和PP在氧化后生成了相似水平的氢过氧化物（约1.0-1.2 nmol/mg）和羰基化合物（约24.4 nmol/mg）。Western blotting表明，FP中的羰基主要位于legumin-α及聚集体中，而PP中主要在~47 kDa vicilin中。LC-MS/MS分析证实了双酪氨酸的生成，FP中水平略高（1.2 nmol/mg），但不足以解释全部聚集现象。此外，仅在FP样品中初步鉴定出双色氨酸加合物，PP中未检测到。对legumin-α三维结构的分析显示，其两个Trp残基相距42.6 ?，分子内di-Trp交联不太可能，表明di-Trp更可能与分子间共价键有关，参与HMMA形成；同时，结构中多个Tyr残基对距离较短（小于15 ?），可解释分子内di-Tyr的形成。
讨论与结论总结
讨论部分总结表明，尽管FP和PP在宏观氧化标志物生成量上相似，但它们的共价交联行为存在显著差异。FP倾向于通过二级自由基自反应形成不可还原的HMMA，由legumin-α参与并涉及di-Tyr、di-Trp及二硫键；而PP的氧化主要导致~47 kDa vicilin的修饰，交联程度有限。混合系统未产生显著的混合交联，其行为可从单独蛋白中预测。
研究结论翻译：由AAPH热解产生的过氧自由基介导的蚕豆和豌豆蛋白的氧化，产生了相似水平的氢过氧化物和羰基等氧化标记物，以及Tyr、Met和Trp的特定氧化产物。然而，SDS-PAGE证据表明，蚕豆蛋白比豌豆蛋白更容易形成高分子质量聚集体。LC-MS/MS分析证实了di-Tyr的形成并初步鉴定了di-Trp物质，支持不可还原的共价交联参与了观察到的聚集模式。利用legumin-α的三维结构合理化了这些加合物的形成，它们可能与二硫键一起，部分促进了蚕豆蛋白样品中观察到的分子间交联。总体而言，这些结果表明蚕豆和豌豆蛋白在过氧自由基引发的聚集行为上存在显著差异，说明单独的氧化程度并不必然能预测这些蛋白质的共价交联。未来的研究应在热处理或高水分挤压等真实加工条件下验证这些氧化途径。
