基于内转录间隔区测序的瓜尼卡州立森林洞穴真菌群落特征分析

《Microbiology Resource Announcements》：Fungal community profiles from Guánica State Forest caves revealed by internal transcribed spacer sequencing

　　

摘要

洞穴生态系统栖息着能够耐受恶劣条件的真菌群落。本研究采用内部转录间隔区测序技术，评估了波多黎各吉瓦尼卡州立森林中四个洞穴的真菌群落。这些图谱将作为参考依据，为深入了解这些复杂而极端生态系统中的真菌多样性及生物勘探提供见解。

公告

洞穴是极端、贫营养、黑暗的生态系统，温度变化较大（1、2），但其中却维持着多样化的微生物群落，参与养分循环并产生具有生物医学潜力的化合物（2）。真菌参与分解作用、养分循环、矿物风化和产生抗菌、抗氧化及抗癌代谢物（3、4）。尽管波多黎各北部石灰岩喀斯特带的洞穴已通过16S rDNA扩增子测序进行了表征，南部洞穴的真菌群落也已使用ITS测序进行了评估，但吉瓦尼卡州立森林中的洞穴仍缺乏深入研究（5、6）。吉瓦尼卡干林提供了独特的研究背景，因为亚热带干燥条件、高温、季节性水分限制和干燥胁迫可能影响真菌群落结构。为表征真菌多样性和生物勘探潜力，研究人员对吉瓦尼卡州立森林内的四个洞穴进行了采样（表1）。在无菌Whirl-Pak袋中采集30克富含蝙蝠粪便的表层土壤，并在4°C条件下冷藏至DNA提取。从每个样本的10克悬于20 mL含0.02克溶菌酶的Z缓冲液中的溶液中提取基因组DNA。通过反复冻融循环破坏细胞，随后使用2.25 mL十二烷基硫酸钠和1.5 mL异硫氰酸胍在65°C下裂解2小时。裂解物经离心澄清，用等体积氯仿提取，水相在?20°C下用1体积异丙醇过夜沉淀。DNA沉淀离心后，气干，重悬于T₁₀E₁₀（10 mM Tris/10 mM EDTA）中，并于?20°C储存（7–9）。通过凝胶电泳筛选不超过25 kb的DNA片段，并按照制造商的方案使用β-琼脂糖酶I纯化（10）。纯化后的DNA提交至Molecular Research DNA Laboratory（MR DNA，美国德克萨斯州Shallowater）进行bTEFAP Illumina 20K ITS1–2测序（11）。使用ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）反向引物（12）扩增ITS1区域，使用HotStarTaq Plus Master Mix Kit（Qiagen，美国）。PCR条件为：95°C 5分钟；30个循环，95°C 30秒，53°C 40秒，72°C 1分钟；72°C 10分钟。测序在Illumina MiSeq平台上进行，使用2 × 300 bp双端 reads。去多路化的reads导入QIIME 2版本2026.1（Python 3.10.14），并使用ITSxpress版本2.1.4进行修剪（13）。使用DADA2进行去噪，无需额外的修剪或截断（14）。除非另有说明，均使用默认参数。分类学归属使用2025年2月19日发布的UNITE版本10.0动态真菌分类器，适用于QIIME 2版本2026.1。四个洞穴中，保留了超过190万条非嵌合体reads，平均保留率为83.62%（表1）。共鉴定出2,360个ASVs。未分类真菌占reads的18.50%；伞菌目（Agaricales，14.37%）、球腔菌目（Mycosphaerellales，12.96%）、肉座菌目（Hypocreales，9.63%）、鸡油菌目（Cantharellales，7.63%）、未分类罗塞尔菌门（Rozellomycota，5.99%）和牛肝菌目（Boletales，5.48%）是最丰富的类群，揭示了各采样点间多样化的真菌群落（图1）。

表1

表1 样本编号和DADA2分析结果

采样洞穴	样本编号	坐标	采集日期（日/月/年）	原始输入reads	通过过滤器的输入百分比	去噪后	非嵌合体	非嵌合体百分比
Cueva Carmen（卡门洞）	CAR	17°57′33″ N, 66°51′10″ W	28/6/2025	653,275	97.28	564,651	573,284	81.39
Cueva Eugenio (?o) Guerras（欧亨尼奥·瓜耶拉斯洞）	EUG	17°57′43″ N, 66°50′50″ W	13/10/2025	697,521	96.46	670,311	622,909	89.3
Cueva El Refugio（埃雷富希奥洞）	REF	17°57′35″ N, 66°51′11″ W	28/6/2025	441,982	97.42	428,770	357,405	80.86
Sumidero Lluveras（卢维拉斯洞）	SUL	17°57′51″ N, 66°50′45″ W	13/10/2025	433,895	93.76	405,038	359,723	82.91

图1

图1 四个波多黎各洞穴中真菌群落目水平的相对丰度。（A）显示各洞穴中真菌目相对丰度的分类群条形图。（B）吉瓦尼卡州立森林地图，标示了采样洞穴的位置。地图由ángel M. Nieves-Rivera绘制。

致谢

我们感谢洞穴探险俱乐部（Grupo Espeleológico del Oeste, Inc.和Gruta Troglodita Norman Veve, Inc.）以及Walter Díaz Rodríguez提供的后勤支持及采样洞穴的定位。

Camila M. Martínez-Llaurador、Isabel Aguirre-Ortiz、Francisco J. Román-Soto、Naomy M. Chaparro-Mata：形式分析、调查和撰写（初稿）；Peter A. Camacho-Nazario：形式分析和撰写；Josué Rodríguez-Ramos：撰写（审阅和编辑）；ángel M. Nieves-Rivera和Miguel J. Martínez-González：采样、审阅和编辑；Miguel Canals-Mora：审阅和编辑；Carlos Rios-Velazquez：撰写（审阅和编辑）。