雌性偏向的26RFa/QRFP肽含量及转录水平在斑胸草雀（Taeniopygia guttata）的中脑中

《Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology》：Female-biased 26RFa/QRFP peptide content and transcript levels in the zebra finch ( Taeniopygia guttata) diencephalon

　　

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  我们开发了一种针对斑胸草雀26RFa/QRFP的新抗血清。
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  该抗血清通过ELISA、免疫组织化学和原位杂交技术进行了验证。
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  雌性斑胸草雀的中脑26RFa/QRFP肽水平高于雄性。
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  中脑中的26RFa/QRFP mRNA水平存在性别差异。
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  这些发现表明鸟类26RFa/QRFP信号传导存在性别差异。

引言

斑胸草雀（Taeniopygia guttata）是一种常用于研究发声学习以及环境对内分泌反应和行为影响的鸣禽模型（Cooper等，2020年；Crino等，2017年；Hauber等，2021年）。在斑胸草雀中发现了26RFa/QRFP的同源肽，脑室内给药可以增加其食物摄入量。此外，雌性斑胸草雀下丘脑中与进食调节相关的区域（包括腹内侧核VMN和外侧下丘脑区LHy）表达了26RFa/QRFP前体mRNA。与哺乳动物类似，鸟类的VMN传统上被认为是饱腹中枢，其损伤会导致暴饮暴食和肥胖；而LHy则作为进食中枢，损伤会导致厌食和快速体重下降；值得注意的是，鸟类的VMN损伤还与多种与年度周期相关的生理和行为变化有关，包括停止换羽、性腺发育不全以及迁徙行为的完全停止（Kuenzel等，1999年）。

尽管已确定斑胸草雀中26RFa/QRFP前体mRNA的分布及其促进食欲的作用，但目前尚缺乏分析该物种内源性26RFa/QRFP肽表达的工具，因此难以检测26RFa/QRFP系统在肽水平上是否存在性别偏向性表达。这一空白非常重要，因为其他脊椎动物中已经观察到26RFa/QRFP活性的性别依赖性；例如，中枢给药26RFa/QRFP可以刺激雌性大鼠的黄体生成素分泌，但不会影响雄性大鼠（Navarro等，2006年）。因此，需要直接检测鸣禽中26RFa/QRFP表达的性别差异。

在这项研究中，我们制备了一种针对斑胸草雀26RFa/QRFP肽的新抗血清，并通过竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）验证了其特异性，同时通过免疫组织化学（IHC）和原位杂交（ISH）对免疫反应细胞体和mRNA转录本进行了组织学交叉验证。利用这种抗血清，我们测定了包括下丘脑在内的中脑区域的成熟26RFa/QRFP肽含量，并通过定量聚合酶链反应（qPCR）评估了26RFa/QRFP mRNA的表达。这种方法为斑胸草雀26RFa/QRFP的研究提供了实用工具，并首次实现了在肽和转录本水平上评估26RFa/QRFP系统的性别差异。

章节片段

实验动物

实验用的成年斑胸草雀（25只雄性和17只雌性）来自本地饲养场或Azabu大学的繁殖群体。所有鸟类在实验期间均为性成熟个体，年龄至少120天。在这42只鸟类中，6只雄性用于IHC，8只（4雄性和4雌性）用于ISH，16只（9雄性和7雌性）用于ELISA，12只（6雄性和6雌性）用于qPCR。这些鸟类被饲养在12小时光照/12小时黑暗的单个鸟笼室内。

通过ELISA对抗血清滴度进行了系列稀释测试，后续ELISA实验使用了1:500的稀释度（图1a）。在竞争性ELISA中，合成的26RFa/QRFP肽以浓度依赖的方式取代了结合位点。相比之下，GnIH、PrRP、NPFF、Kisspeptin-10和mesotocin没有竞争作用（图1b）。为了确认竞争性ELISA测量组织提取物中类似26RFa/QRFP的免疫反应性的有效性，我们检测了标准品和

为了克服常见的技术问题

在准备这项工作时，作者使用了Consensus、DeepL和OpenAI的ChatGPT来帮助总结背景文献，以提高手稿的清晰度和可读性。使用这些工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对最终版本的手稿负全责。

Moeka Matsumura：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，调查，资金获取，正式分析。Sumire Hamasaki：撰写 – 审稿与编辑，调查，正式分析。Kanaho Moto：撰写 – 审稿与编辑，调查。Yurika Abe：正式分析，调查，撰写 – 审稿与编辑。Yasuko Tobari：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，监督，资源管理，项目管理，方法论，调查，

不适用。

所有实验程序均获得了Azabu大学动物使用伦理委员会的批准（授权编号220404-2），并遵循了体内实验报告（ARRIVE）指南。

本研究得到了Moritani奖学金基金会的研究资助，以及Azabu大学人类-动物共生科学中心和多样性、公平与包容中心的机构研究资金的支持。

我们感谢Moritani博士和Harauma博士（BABILON，食品功能探索有限公司）慷慨借给我们一台手动压力注射器。同时感谢Mizunoya博士和Takeda博士（Azabu大学）对手稿的仔细阅读以及提供的宝贵意见和建议。

Moeka Matsumura|Sumire Hamasaki|Kanaho Moto|Yurika Abe|Yasuko Tobari