从野外到基因组：濒危格林纳达蛙（Pristimantis euphronides）的非致死性现场仅纳米孔基因组组装

《BMC Genomics》：From field to genome: non-lethal, on-site nanopore-only assembly of the endangered Grenada Frog (Pristimantis euphronides)

　　

摘要

背景

Pristimantis（普里斯蒂曼蟾属）是物种最丰富的脊椎动物属之一，已有超过600个描述物种，但在本研究之前，该属的任何成员以及隐蹼蟾科或节蛙科均无全基因组组装可用。格林纳达蟾（Pristimantis euphronides）是一种极度濒危的直接发育两栖动物，为小安的列斯群岛格林纳达岛山地雨林的孪生种。参考基因组是濒危物种保护的基础工具，但其生产通常依赖于破坏性取样、大型机构基础设施或向境外运送生物材料。

结果

我们展示了P. euphronides的1.75 Gb支架水平参考基因组，该基因组由一只野生雌性个体的非致死性取样（趾部活检、血液拭子和口腔拭子）组装而成。所有湿实验步骤，包括Oxford Nanopore Technologies（ONT）MinION测序，均在境内使用便携式设备完成，下游分析则运行于笔记本电脑级硬件及从格林纳达远程访问的服务器上。Flye-Medaka组装体以Eleutherodactylus coqui为参考，通过RagTag进行支架构建，包含13条假染色体，支架N50为117.8 Mb，四足动物BUSCO完整度达到91.4%，并注释了28,071个蛋白编码基因。与另外三个雨蟾总科基因组的跨物种同线性分析计算出该物种的基础核型为n = 16，与先前细胞遗传学计数一致，表明参考引导的假染色体并不对应真实的单倍体染色体数目。覆盖度分析在两个支架上识别出候选Z连锁区域，并发现一组未定位的连续序列，其序列特征与C带技术描述的异染色质W染色体一致，为Pristimantis的性染色体分析提供了初步框架。

结论

该全基因组组装为一个超多样性的直接发育蛙类类群提供了参考，该类群此前的比较研究仅依赖少量标记基因。在缺乏染色质构象捕获方法（如Hi-C，该方法与非致死性野外取样不兼容）的情况下，以最为接近的、分化约5200万年的可用染色体水平雨蟾总科基因组作为参考进行引导支架构建，提供了一种可行的替代方案。该非致死性、境内完成、仅使用ONT的工作流程表明，对于重复序列丰富的受关注保护脊椎动物，可以在不进行破坏性取样或不外包给外部测序或生物信息学服务的情况下，生产出支架水平的参考基因组。