轮藻纲中由荧光染色揭示的核多样性及其对基因组大小估计的启示

《Planta》：Nuclear diversity in Charophyceae revealed by fluorescence staining and its implications for genome size estimation

　　

研究人员建立了一种在轮藻纲（Charophyceae）中可靠可视化细胞核的protocol，揭示了跨细胞类型与物种的多样化核组织，并确定了适用于流式细胞术（flow cytometry）估计基因组大小的细胞类型。轮藻纲是和陆生植物近缘的多细胞绿藻，也是理解植物演化的经典模型系统，但基因组大小等关键细胞参数仍鲜有表征。研究人员联合荧光显微镜、透射电子显微镜（TEM）与流式细胞术，表征了轮藻科（Characeae）跨细胞类型与物种的核多样性，并筛选适于基因组大小估计的细胞类型。在三种DNA嵌入荧光染料中，碘化丙啶（propidium iodide, PI）对细胞核的标记最为可靠。核形态在不同细胞类型间差异显著：单核細胞见于营养顶端细胞、卵囊冠（coronula）及雄器（antheridium）精丝（spermatogenous filament），而多核化在皮层细胞、刺细胞、托叶状结构（stipulode）及假根（rhizoid）等组织中占主导。Chara hispida 沿叶状体（thallus）轴线的核横截面积呈显著梯度：顶端节间核更大且异质性更高，基部节间核更小且更均一，与可能的核内多倍化（endopolyploidy）一致。TEM确认了新月形结构的核身份。假根与刺细胞中可见较大细胞核，仅 Sphaerochara canadensis 表现出有序的核排布模式。全叶状体制备未产生明确的核峰，而 Chara tomentosa 雄器给出尖锐峰，据此估计1C基因组大小为5.32 pg。该protocol为轮藻纲核可视化与基因组大小估计提供了简洁可重复的框架，并助力解决该类中多核化机制与功能、减数分裂位点及基因组演化等长期问题。

研究背景与立项依据

轮藻纲（Charophyceae，链形植物门 Streptophyta）为具明确细胞分化的水生多细胞绿藻，曾长期被视为陆生植物最近亲，现系统发育基因组学将接合绿藻纲（Zygnematophyceae）推至该位，但其形态复杂性与 Chara braunii 基因组所揭示的与胚胎植物（embryophyte）的共性仍使其成为理解水生藻类向陆生植物过渡的关键类群。然而该类群基因组大小（genome size）这一基础细胞参数长期未决：已有少量研究依赖 Schiff 试剂染色与雄器光度法，流式细胞术虽在植物中成熟，研究人员在 Chara tomentosa 全叶状体初筛中却无法获得明确核群体，推测与其独特细胞架构有关——细胞常多核化，核大小、形状乃至DNA含量可变，且减数分裂位点（oospore萌发、配子形成或原丝体特定节）长期存疑。在此背景下，研究人员旨在建立可靠核可视化方案、系统记录核形态大小跨细胞类型与物种的差异，并筛选均质细胞类型作为流式基因组大小估计基础。

本研究发表于《Planta》。

主要技术方法概要

研究人员采集并培养多种轮藻科物种（表1所列采样点种群），以荧光显微镜比较 PI、DAPI、SYTOX Green 三种DNA嵌入染料对核的标记效果；以 TEM 固定超薄切片确认异常核形（如新月形）身份；用 Fiji ImageJ 对 Chara hispida 荧光图中核横截面积做阈值化定量，并以 Friedman 秩和检验评估顶/中/基节间差异；流式细胞术采用 CytoFLEX 仪，以黑麦（Secale cereale）叶为内标，对全叶状体与雄器分别制样，PI 染色后判峰并计算1C基因组大小。

研究结果

荧光显微镜

比较 PI、SYTOX Green、DAPI 发现 PI 标记最清晰、背景最低，SYTOX Green 与 DAPI 标记核数少且背景弥散，PI 在托叶状结构中着色最佳，故推荐轮藻纲常规核可视化与流式用 PI。

核形态与分布

PI 染色显示 Chara hispida 顶端区核密度高、多核化且形态多样（圆、椭圆、长条、新月形），顶端初始细胞为单核；TEM 确认新月形结构为含三个核仁的细胞核。基部节间核密度低、大小形状更均一。

核横截面积梯度

对 Chara hispida 顶/中/基节间核横截面积定量显示，中位数与极差均从基向顶显著增大（Friedman 检验显著，Kendall's W 报告效应量，BH 校正两两比较显著），提示顶端可能伴核内多倍化。

物种与组织特异性观察

假根中同时存在小圆核与数百微米长条形核；卵囊冠（Chara hispida、Tolypella nidifica、Nitella opaca）为单核/细胞；Chara aculeolata 刺细胞见数百微米长核；仅 Sphaerochara canadensis 核呈规则间距排布，其余无皮（ecorticated）物种无此现象。雄器精丝核形状大小均一、密排，易被 PI/SYTOX Green 标记。

流式细胞术

全叶状体无明确核峰；Chara tomentosa 雄器给出尖锐峰（PE-A 通道 234.5×10³），加黑麦内标后雄器峰移至 267.5×10³，黑麦峰在 813.5×10³，据内标推算雄器1C基因组大小为 5.32 pg。

讨论与结论翻译

讨论指出 PI 因序列非依赖性嵌入双链DNA且背景低，优于偏好AT小沟的 DAPI 与源自活性染色的 SYTOX Green；轮藻高度果胶化多阴离子细胞壁可能差异阻滞染料渗透。核形多样（含新月形经TEM确证）与前人一致，缢缩或反映（无）丝分裂晚期，无丝分裂的不均等染色质分隔可解释全叶状体流式信号宽散。Chara hispida 顶-基核面积梯度与 Shen（1967b）DNA含量梯度（顶端2C至节间4C–32C）方向吻合，但本研究仅以2D面积为体积/DNA间接代理，核内多倍化为假设而非证明，须与种级全基因组加倍（polyploidy）区分。假根与刺细胞大核、Sphaerochara canadensis 规则核阵列为物种特异现象，后者或利于均质基因表达与高生长率，其细胞骨架机制待查。单核区限于顶端细胞、卵囊冠、雄器精丝，其中雄器精丝提供均质核群，获 Chara tomentosa 5.32 pg（1C），与 Maszewski & Ko?odziejczyk（1991）7.4 pg 及属内 1.92–19.6 pg 区间并存，差异或来自方法、标准、种群。研究者强调需以雄器为材料联用流式与染色体计数，分离核内多倍化与真多倍化。

结论（翻译）：研究人员表明轮藻纲核系统在个体内与物种间具高度形态多样性，所呈样本制备 protocol 简便，可支撑显微镜与流式核分析，助于解决该类群中减数分裂位点、多核细胞形成机制与功能及基因组大小演化等长期与新发问题。