《Journal of NeuroVirology》：CRISPR-mediated excision of HTLV-1 reduces proviral loads in PBMCs from HAM/TSP patients
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CRISPR技术正逐渐成为一种消除慢性病毒感染（如疱疹病毒和HIV）的极具前景的治疗方法。研究人员首次在体外证明，CRISPR可用于切除HTLV-1基因组并降低HAM/TSP（HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中的前
CRISPR技术正逐渐成为一种消除慢性病毒感染（如疱疹病毒和HIV）的极具前景的治疗方法。研究人员首次在体外证明，CRISPR可用于切除HTLV-1基因组并降低HAM/TSP（HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中的前病毒载量。采用由靶向HTLV-1 env基因和3’LTR序列的两个gRNA组成的CRISPR-RNP（核糖核蛋白）复合物进行单次处理，即可切除跨越tax和HBZ基因的2613 bp前病毒基因组片段，且未检测到脱靶活性。此外，CRISPR处理后5天，前病毒载量降低超过50%。研究数据表明，CRISPR-Cas9基因编辑技术可作为一种消除感染细胞中HTLV-1 DNA的治疗策略，并可能成为治愈HAM/TSP的平台。
人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）是一种致病性人类向性逆转录病毒，全球约有1000万人感染。HTLV-1感染本身会导致校正后全因死亡率增加57%，这主要归因于慢性炎症和免疫功能障碍。部分感染者会进展为成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL）或HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性轻截瘫（HAM/TSP），两者的发生率均约为2%。其中，HAM/TSP是一种进行性神经炎症性脊髓退行性疾病，临床表现为慢性背痛、膀胱/肠道功能及肢体运动控制丧失，最终丧失独立行走能力。其发病机制涉及异常活化的HTLV-1感染CD4
+ T细胞浸润脊髓，随后募集HTLV-1特异性CD8
+ T细胞，二者相互作用引发炎症性旁立者效应，导致脊髓炎和脊髓萎缩。同时，浸润细胞释放的IFN-γ可刺激星形胶质细胞分泌CXCL10，进而吸引CXCR3
+免疫细胞，形成正反馈炎症循环。研究发现，HAM/TSP患者的前病毒载量（PVL）显著高于无症状携带者，且PVL与疾病进展速率密切相关。然而，由于HTLV-1储存库通过感染细胞的克隆增殖维持而非活跃病毒复制，传统抗逆转录病毒疗法对其无效。同时，HTLV-1依赖宿主细胞具有校对功能的聚合酶进行复制，导致其基因组稳定性高、序列变异率低于HIV-1，这使其成为基因工程治疗策略的理想靶点。
基于上述背景与临床未满足需求，研究人员在《Journal of NeuroVirology》发表了一项概念验证研究。研究人员首次在体外证明，利用双引导RNA（gRNA）的CRISPR-Cas9平台可高效切除HTLV-1前病毒基因组中的env-3’LTR区域（2613 bp片段，涵盖关键的tax和HBZ基因），并在来自10名HAM/TSP患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中实现超过50%的前病毒载量（PVL）降低，且未检测到脱靶编辑。该研究为通过消除前病毒储存库以治愈HAM/TSP提供了首个理论和技术平台，具有重要的转化医学意义。
技术方法：研究人员从队列中获取了10名HAM/TSP患者的PBMCs作为临床样本。在电穿孔前，使用CD3/CD28激活剂和IL-2对细胞进行活化扩增。基于患者NIC0071的HTLV-1a-TC亚型序列，利用CRISPOR生物信息学工具设计SpCas9 gRNA，优先选择靶向env和3’LTR区域的gRNA。采用4D-Nucleofector将Cas9/gRNA核糖核蛋白（RNP）复合物导入细胞。通过PCR扩增和桑格测序验证DNA水平的靶向切除，并使用ICE软件进行插入缺失（InDel）分析。使用特异性TaqMan探针通过qPCR定量前病毒载量；通过对预测脱靶位点进行PCR和桑格测序评估编辑特异性。
研究结果：
HAM/TSP患者来源的HTLV-1序列与ATK-1参考基因组不同。研究人员早期基于ATK-1参考分离株（属于HTLV-1a-Jpn亚型）设计的gRNA未能成功编辑，提示参考序列不匹配问题。通过对该队列10名患者进行env-3’LTR区域测序和系统发育分析，发现除一例（NIC1284，属于HTLV-1a-WA亚型）外，其余序列均与HTLV-1a-TC亚型（亚型a（世界型），亚组A（跨大陆））聚类。这一发现解释了先前编辑失败的原因，并证实针对特定患者群体设计gRNA时，必须使用与其病毒株匹配的序列。
单次RNP-CRISPR处理HAM/TSP PBMCs导致前病毒基因组切除且无脱靶编辑。研究人员针对患者NIC0071的序列筛选出四个候选SpCas9 gRNA（依据预测效率和特异性评分）。通过电穿孔将RNP复合物导入该供者PBMCs，基于PCR和InDel分析确定了两个最佳gRNA：env-312rev和3’LTR-2034rev。单独使用时，二者在靶位点的InDel形成率分别为57%和61%；组合使用时，成功切除2613 bp env-3’LTR片段。将此组合应用于其余供者，在5名高PVL供者（NIC2883, NIC0560, NIC1026, NIC0745, NIC1022）中通过单轮PCR检测到对应于切除后连接的498 bp截短扩增子，并经桑格测序确认。对于低PVL供者，通过半巢式PCR在另外3名供者（NIC0667, NIC3024, NIC1284）中确认了切除。脱靶分析方面，研究人员对预测的15个脱靶位点（7个针对env-312rev，8个针对3’LTR-2034
