《Veterinary Research》：Evaluation of An I226R and A137R deletion mutant from a genotype I/II recombinant African swine fever virus strain as a live attenuated vaccine in pigs
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摘要
高致死性基因I/II型重组非洲猪瘟病毒(ASFV)毒株在我国的出现使现有的基于基因II型的弱毒活疫苗失效，凸显了对新型疫苗候选株的迫切需求。尽管A137R或I226R单基因缺失对基因II型毒株已显示出保护潜力，但其在重组毒株背景下的效力和安全性尚未被探索
摘要
高致死性基因I/II型重组非洲猪瘟病毒(ASFV)毒株在我国的出现使现有的基于基因II型的弱毒活疫苗失效，凸显了对新型疫苗候选株的迫切需求。尽管A137R或I226R单基因缺失对基因II型毒株已显示出保护潜力，但其在重组毒株背景下的效力和安全性尚未被探索。研究人员利用同源重组技术，以基因I/II型重组ASFV毒株JX23-02为亲本，构建了单基因缺失突变株(JX23-02ΔI226R)和双基因缺失突变株(JX23-02ΔI226RΔA137R)。研究人员在体外和猪体内评估了这些突变株的复制动力学、致病性、免疫原性和保护效力。两种缺失突变株在猪肺泡巨噬细胞中的复制能力均显著降低。JX23-02ΔI226R免疫组存活率为40%，存活猪能够抵抗致死性攻毒。相比之下，JX23-02ΔI226RΔA137R完全致弱：所有免疫猪在攻毒后均存活且无任何临床症状(最高直肠温度40.2°C)，并产生了可检测的p54特异性抗体应答。此外，双基因缺失组的病毒排毒和组织病毒载量显著低于单基因缺失组。双基因缺失突变株JX23-02ΔI226RΔA137R是针对基因I/II型重组ASFV毒株的一种有前景的弱毒活疫苗候选株，支持采用多基因缺失策略进行ASF疫苗开发。
基于基因I/II型重组非洲猪瘟病毒I226R与A137R缺失突变株的弱毒活疫苗研究解读
**一、研究背景与问题**
非洲猪瘟(ASF)是一种严重致死性传染病，感染家猪和野猪，对全球养猪业造成巨大经济损失。目前，除越南外，尚无安全有效且可商业化应用的ASF疫苗，疫区主要依靠扑杀感染猪来控制疫情。非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种大型双链DNA病毒，属于Asfarviridae科Asfivirus属，其基因组长度为170–193 kb，编码超过150个开放阅读框(ORF)。根据编码主要衣壳蛋白p72的B646L基因末端序列，ASFV被分为24种基因型。2018年我国首次暴发ASF后，疫情迅速传播至多个亚洲国家。2023年，我国出现了高致死性基因I型和II型重组ASFV毒株，基因组分析显示这些重组毒株超过56%的基因组片段源自基因II型，其余源自基因I型。本研究使用的JX23-02毒株属于该谱系，与已报道的重组毒株基因组核苷酸一致性达99.9%以上。此前的关键问题是，基于基因II型毒株开发的弱毒疫苗无法有效保护基因I/II型重组毒株的感染，因此亟需开发针对重组毒株的新型疫苗。
基因缺失弱毒活疫苗的研发已取得显著进展。先前研究表明，I73R、I177L、MGF505-7R、A137R和I226R等单基因缺失在实验模型中能够提供针对基因II型强毒攻毒的保护。然而，单基因缺失突变株的安全性仍需审慎评估，多基因缺失毒株也面临病毒复制能力下降和免疫原性欠佳等挑战。值得注意的是，重组毒株JX23-02的序列分析显示，其A137R基因与基因I型毒株100%一致，而I226R基因与基因II型毒株100%一致，这为在基因I/II型杂交背景下评估基因缺失提供了独特的遗传背景。然而，针对这些基因缺失的功能研究大多基于基因II型ASFV开展，缺乏其他流行病学重要基因型尤其是新出现的基因I/II型重组毒株中的比较分析，其在非基因II型背景下的基因型依赖性作用、安全性和免疫原性影响均不明确。因此，本研究旨在从基因I/II型重组毒株JX23-02出发，构建并比较I226R单缺失以及A137R/I226R双缺失的等基因突变株，系统评估这些缺失对该重组病毒复制、致弱、安全性和保护效力的影响，为针对重组毒株的疫苗设计提供关键见解，并加深对A137R和I226R基因型特异性功能的理解。
**二、主要技术方法**
本研究采用同源重组技术构建基因缺失毒株。以pMD18-T载体为骨架，分别构建含有I226R基因上下游同源臂和p72启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的单基因缺失供体质粒，以及含有A137R基因上下游同源臂和mCherry荧光蛋白表达盒的双基因缺失供体质粒。通过将供体质粒转染至猪骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)后感染亲本毒株JX23-02，经荧光筛选和有限稀释法纯化获得重组病毒。病毒复制动力学通过在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中以MOI 0.1感染不同时间点取样测定半数组织培养感染量(TCID50)进行评估。动物实验中，采用长白猪分为免疫组和攻毒对照组，通过肌肉注射途径接种和攻毒，每日监测直肠温度并观察临床症状。病毒载量采用世界动物卫生组织(WOAH)推荐的qPCR方法检测血液、口拭子、肛拭子及组织样品中p72基因拷贝数。血清p54特异性抗体水平采用实验室建立的间接ELISA方法检测。样本队列来源包括从约2月龄猪支气管肺泡灌洗液和骨髓穿刺液分离的PAMs和BMDMs，以及从当地猪场获取的试验用猪。所有动物实验均在生物安全三级实验室中进行。
**三、研究结果**
**JX23-02在猪中的高致病性**
研究人员以100 TCID50剂量分别感染JX23-02、SY18和HuB20毒株，并与PBS对照组进行比较。结果显示三种毒株的死亡率均为100%，但发病进程存在差异。JX23-02感染猪在攻毒后2天即出现发热，最早于5天达到人道终点；SY18感染猪3天开始发热，最早7天达到人道终点；HuB20感染猪11天才开始发热，发热持续约10天，最早21天达到人道终点。该结果表明，基因I/II型重组毒株JX23-02具有与强毒株SY18相当的高致病性和更快的发病进程。
**JX23-02ΔI226R和JX23-02ΔI226RΔA137R缺失毒株的构建与生长特性**
通过同源重组和荧光标记筛选，研究人员成功构建了单基因缺失毒株JX23-02ΔI226R(以EGFP替换I226R基因)和双基因缺失毒株JX23-02ΔI226RΔA137R(在单缺失基础上以mCherry替换A137R基因)，并通过PCR验证纯化成功。由于I226R与I243L开放阅读框末端有4个碱基重叠，删除时保留了I226R基因3'端22个碱基以避免破坏I243L基因完整性。体外复制动力学结果显示，与亲本毒株相比，两种缺失毒株在感染后24、48和72小时的病毒滴度显著降低(P<0.01)；在96和120小时，亲本毒株滴度显著高于双基因缺失毒株(P<0.05)，而单基因缺失毒株在120小时与亲本无显著差异。这表明I226R和A137R缺失对病毒体外复制能力具有阶段特异性抑制作用，尤其在感染中期(24–72小时)。
**JX23-02ΔI226R具有残留毒力但可为存活猪提供保护**
以105.0 TCID50剂量免疫5头猪后，3头猪分别在11、12和16天达到人道终点被安乐死，死亡猪呈现典型的ASF临床症状，包括发热(峰值达41.5°C)、精神沉郁和厌食。其余2头猪在21天观察期内存活，存活率为40%。存活猪在免疫后3天开始出现发热，发热持续5–13天，最高体温达到40.9°C和40.8°C，但在症状出现后3–4天内完全恢复。免疫后21天以100 TCID50 JX23-02攻毒，2头存活猪仅出现一过性体温升高，在攻毒后28天观察期内均存活且生理状态正常。对照组猪在攻毒后3天体温急剧升高，5–8天内全部达到人道终点。该结果表明JX23-02ΔI226R免疫虽然残留毒力导致60%死亡率，但存活猪能够获得针对亲本强毒致死性攻毒的保护效力。
**JX23-02ΔI226RΔA137R完全致弱并提供100%保护效力**
以105.0 TCID50剂量免疫5头猪后，所有猪在免疫观察期均存活。免疫后5天出现轻微发热，持续1–3天，整个观察期间体温波动但未超过40.1°C。免疫后21天以100 TCID50亲本毒株攻毒，所有猪均存活且未出现ASF临床症状。整个实验期间猪的直肠温度范围为38.4°C至40.2°C，仅在免疫后6–8天出现一过性轻度升高(峰值40.2°C)，无持续发热。该结果表明JX23-02ΔI226RΔA137R完全致弱，所有免疫猪在亲本基因I/II型重组毒株攻毒后均能存活且无临床症状。
**排毒检测**
免疫后口、肛拭子qPCR检测显示，JX23-02ΔI226R免疫组中有4头猪在免疫后7–14天口或肛拭子呈阳性，且所有猪均检出病毒血症。相比之下，JX23-02ΔI226RΔA137R免疫组所有拭子样本均为阴性。攻毒后，对照组猪从攻毒后3天起即可检测到高拷贝数病毒排毒；JX23-02ΔI226R免疫组有1–2头猪检出排毒；而JX23-02ΔI226RΔA137R免疫组仅1头猪的肛拭子呈弱阳性。该结果表明JX23-02ΔI226RΔA137R的排毒水平显著低于JX23-02ΔI226R组。
**病毒血症与组织病毒载量比较**
攻毒后血液qPCR检测显示，对照组猪血液中病毒DNA水平极高，各组织病毒载量亦高。JX23-02ΔI226R免疫组血液病毒含量显著高于JX23-02ΔI226RΔA137R组，且在攻毒后28天血液中病毒基因组转为阴性。在JX23-02ΔI226R组中，免疫后被安乐死猪的组织病毒载量高，所有类型组织样本qPCR均为阳性；存活猪的结肠、空肠和骨髓中仍可检出病毒，提示组织器官中的病毒不能被完全清除。在JX23-02ΔI226RΔA137R组中，病毒血症在攻毒后21天消失，血液qPCR转为阴性；组织检测中，肾脏、腹股沟淋巴结、胸腺和胃在所有猪中均为阴性，脾脏和骨髓各2头猪检出病毒且载量较低，颌下淋巴结病毒载量最高(3.11 log10 copies/mL)。该结果表明双基因缺失株在体内抑制病毒复制和播散的能力显著优于单基因缺失株。
**免疫应答**
p54特异性抗体动力学检测显示，所有免疫组在免疫后7天即可检出抗体，在免疫后17–21天左右达到峰值。攻毒后抗体水平略有升高后随时间适度降低，但整个观察期间维持在较高的阳性水平。对照组猪攻毒后仅能检出低水平p54抗体。该结果表明两种基因缺失毒株均能诱导强烈的p54特异性体液免疫应答。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，本研究成功从基因I/II型重组ASFV毒株JX23-02构建出单基因缺失毒株JX23-02ΔI226R和双基因缺失毒株JX23-02ΔI226RΔA137R。I226R和A137R基因缺失显著削弱了ASFV的体外复制能力，为减毒疫苗研制提供了理论依据。动物实验揭示了不同水平的免疫保护：JX23-02ΔI226R保留残余毒力但可诱导有效保护，而JX23-02ΔI226RΔA137R额外缺失A137R进一步降低了毒力且未损害免疫原性，证实了双基因缺失在ASFV致弱中的协同效应。双基因缺失组病毒血症持续时间更短、病毒载量更低，其增强的安全性可能归因于同时删除两个免疫调节基因的叠加效应——I226R可抑制NF-κB和IRF3激活，A137R通过促进TBK1的自噬依赖性降解抑制cGAS–STING介导的IFN-β产生，两者同时缺失可引发更强烈的固有免疫应答，限制病毒在体内的复制和播散。与先前报道相比，SY18ΔI226R未引起明显临床症状且全部猪存活，而本研究的JX23-02ΔI226R存在较高残留毒力，差异可能源于亲本毒株遗传背景不同。HLJ/18-7GD疫苗无法保护重组毒株，而JX23-02ΔI226RΔA137R通过多基因缺失策略成功应对了这一挑战。此外，A137R的完全缺失可作为区分感染与免疫动物(DIVA)标记。研究也存在局限性，包括毒力返强风险和保护性免疫持续时间需进一步评估，qPCR无法区分疫苗株和攻毒株，以及与田间毒株共感染可能产生重组体的风险。A137R和I226R基因缺失共同作用显著降低了病毒复制能力，JX23-02ΔI226RΔA137R在安全性、免疫原性和保护效力方面均表现优异，JX23-02ΔI226R则诱导了部分保护性免疫但残留毒力。这些结果强调了多基因缺失策略在开发安全有效的ASFV疫苗尤其是针对新兴重组毒株疫苗方面的可行性。该研究发表在《Veterinary Research》。
