多胺高亚精胺生物合成的互斥通路：依赖腐胺或胍丁胺的两种途径

《Journal of Biological Chemistry》：Mutually exclusive pathways for biosynthesis of polyamine homospermidine dependent on putrescine or agmatine

　　

摘要

高亚精胺（homospermidine）是亚精胺（spermidine）的结构类似物，后者是真核生物生长和细胞增殖所必需的一种多胺。真核生物中的脱氧羟腐胺赖氨酸合酶（deoxyhypusine synthase，DHS）可直接利用亚精胺和腐胺（putrescine）合成高亚精胺。非同源性的细菌高亚精胺合酶（homospermidine synthase，HSS）则可直接由两分子腐胺合成高亚精胺。SpeY是细菌中DHS的同源蛋白，在蓝藻的高亚精胺生物合成中不可或缺。近期研究表明，在细菌超嗜热菌 *Thermus thermophilus* 中，SpeY将精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase）产生的两分子胍丁胺（agmatine）偶联，生成N¹,N⁹-双(胍基)高亚精胺（G44G），后者再由脲水解酶转化为高亚精胺。研究人员探究了G44G的合成是否为系统发育多样化的SpeY同源蛋白的共同特征。在此，研究人员证明，来自不同细菌门、且其基因组编码三种不同蛋白折叠类型的精氨酸脱羧酶、并分别与胍丁胺酶（agmatinase）或胍丁胺亚胺水解酶（agmatine iminohydrolase）为伴侣蛋白的SpeY同源蛋白，均能合成G44G。多样化的胍丁胺、N¹-氨丙基胍丁胺及推测的G44G脲水解酶均可将G44G转化为高亚精胺，但与SpeY关联的G44G脲水解酶不能作用于胍丁胺。同样，多样化的胍丁胺、N¹-氨丙基胍丁胺及推测的G44G亚胺水解酶可将G44G转化为N¹,N⁹-双(氨甲酰基)高亚精胺，但与SpeY关联的G44G亚胺水解酶不能作用于胍丁胺。研究人员在SpeY和HSS通路中均鉴定出已新功能化为精氨酸脱羧酶的鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase），且在HSS通路中该酶与胍丁胺酶相关联。因此，细菌高亚精胺生物合成通路要么依赖胍丁胺/SpeY，要么依赖腐胺/HSS。本研究揭示了胍丁胺在细菌多胺生物合成中的新角色，该角色还包括用于亚精胺生成的N¹-氨丙基胍丁胺和羧基氨丙基胍丁胺通路。

论文解读：细菌高亚精胺生物合成的两条互斥通路——胍丁胺/SpeY依赖型与腐胺/HSS依赖型

**一、研究背景与科学问题**

多胺是广泛存在于生物体内的含氨基阳离子小分子，在细胞生长与增殖中发挥重要作用。亚精胺（spermidine，Spd）是最主要的三胺多胺，真核细胞几乎仅含Spd，而细菌中高亚精胺（homospermidine，Hspd）的分布远较真核生物广泛，在多个细菌门中为主要多胺。Hspd的生物合成已知存在两条非同源（nonhomologous）途径：一为细菌高亚精胺合酶（homospermidine synthase，HSS）途径，以NAD⁺为辅因子，将两分子腐胺（putrescine，Put）直接缩合为Hspd；二为真核生物脱氧羟腐胺赖氨酸合酶（deoxyhypusine synthase，DHS）途径，该酶在缺少其天然底物eIF5A时，可将Spd的氨丁基转移至Put生成Hspd。细菌中DHS的同源蛋白SpeY在蓝藻 *Anabaena* sp. PCC 7120中为Hspd生物合成所必需，但其催化机制一度未知。近期在超嗜热菌 *Thermus thermophilus* 中的研究发现，SpeY可将两分子胍丁胺（agmatine，Agm）偶联生成N¹,N⁹-双(胍基)高亚精胺（G44G），后者再由胍丁胺酶（agmatinase/SpeB）水解为Hspd。然而，这一机制是否广泛存在于系统发育多样化的细菌SpeY同源蛋白中，G44G向Hspd转化的酶学特征，以及两条Hspd合成途径（Put/HSS与Agm/SpeY）之间的进化关系，均有待阐明。本研究旨在回答上述问题，该论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

**二、主要技术方法**

研究人员采用多种关键方法开展研究。以大肠杆菌（*E. coli*）BL21系列单基因缺失株（BL21speD、BL21speG、BL21speB）作为异源表达宿主，分别模拟缺乏Spd、Spd充足及缺乏胍丁胺酶（Agm积累）的代谢背景，将来自不同细菌门的多个SpeY、DHS、HSS及下游水解酶基因进行组合共表达。利用高分辨液相色谱-质谱联用（HR-LCMS）对苯甲酰化或未衍生的多胺代谢产物（Hspd、G44G、C44C）进行定性与半定量检测；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行靶向分析；对重组表达纯化的胍丁胺酶（AUH）、胍丁胺亚胺水解酶（AIH）及鸟氨酸脱羧酶（ODC）同源蛋白进行体外酶动力学参数（K_M、k_cat、k_cat/K_M）测定；并通过序列同源比对分析相关基因簇的分布与共线性关系。

**三、研究结果**

**1. 真核DHS在大肠杆菌中仅在亚精胺存在时产生高亚精胺，而SpeY产生N¹,N⁹-双(胍基)高亚精胺**

将人源与拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）的 *dhs* 基因及来自中型嗜温菌 *Candidatus* Fonsibacter ubiquis 的 *speY* 基因分别在大肠杆菌BL21speD、BL21speG和BL21speB中表达。结果显示，人源和植物DHS仅在Spd充足的BL21speG中产生Hspd，在BL21speB中产生较少，而在缺乏Spd的BL21speD中不产生；且DHS在任何菌株中均不产生G44G。相比之下，SpeY在BL21speD和BL21speG中产生Hspd，但在缺乏胍丁胺酶的BL21speB中不产生Hspd，却大量积累G44G。这表明SpeY以Agm为底物合成G44G，且需要胍丁胺酶将其进一步转化为Hspd。

**2. 系统发育多样化的细菌SpeY同源蛋白均产生N¹,N⁹-双(胍基)高亚精胺**

研究人员选取了来自不同细菌门、且基因组编码不同蛋白折叠类型精氨酸脱羧酶（ADC）的SpeY同源蛋白，包括 *Caldilinea aerophila*（Chloroflexota）、*Capsulimonas corticalis*（Armatimonadota）、*Ca.* Sericytochromatia（Cyanobacteriota/Melainabacteria）、*Rhizorhabdus wittichii*（α-变形菌门）和 *Winogradskyella algicola*（Bacteroidota）。上述 *speY* 基因在大肠杆菌中的表达结果与 *Ca.* F. ubiquis SpeY一致：在各菌株中均产生Hspd（BL21speD>BL21speG>>BL21speB），且在BL21speB中大量积累G44G。这说明经G44G合成Hspd是细菌SpeY同源蛋白的普遍特征，而非超嗜热菌所特有。

**3. 多样化的胍丁胺酶同源蛋白可将N¹,N⁹-双(胍基)高亚精胺水解为高亚精胺**

将不同来源的 *speY* 与 *speB*（胍丁胺酶）基因在BL21speB中共表达，发现仅表达 *speY* 时几乎不产生Hspd，而共表达 *speY* 与 *speB* 后所有组合均大量产生Hspd，且各组合间产量差异仅约3.5倍。此外，将 *C. corticalis speY* 与来源更广泛的 *speB* 同源基因（包括通常作用于Agm的大肠杆菌SpeB、作用于N¹-氨丙基胍丁胺的 *Bacillus subtilis* SpeB，以及来自 *Magnetospirillum gryphiswaldense* 的SpeB）共表达，均能产生相当水平的Hspd。动力学分析表明，大肠杆菌SpeB对Agm和G44G的催化效率接近；*B. subtilis* SpeB对G44G的催化效率比Agm高约330倍；而 *C. aerophila* 和 *W. algicola* 的SpeB对Agm无检测活性，仅特异性作用于G44G。据此，研究人员提议将这些特异性水解G44G的酶命名为双胍丁胺脲水解酶（diagmatine ureohydrolase，DUH）/双胍丁胺酶（diagmatinase）。

**4. 多样化的胍丁胺脱亚胺酶/亚胺水解酶同源蛋白可将N¹,N⁹-双(胍基)高亚精胺水解为N¹,N⁹-双(氨甲酰基)高亚精胺**

部分编码SpeY的细菌以胍丁胺脱亚胺酶/亚胺水解酶（AIH/AguA）替代胍丁胺酶。将 *speY* 与来自 *Ca.* F. ubiquis 或 *R. wittichii* 的 *AIH* 基因共表达于BL21speB中，可检测到新化合物N¹,N⁹-双(氨甲酰基)高亚精胺（C44C）的生成。当 *C. corticalis speY* 与来自 *Pseudomonas aeruginosa*、*Enterococcus faecalis*、*Desulfosporinus orientis*、*Rhodothermus marinus*、*Akkermansia muciniphila*、*Hydrogenimonas thermophila* 和 *Bacteroides thetaiotaomicron* 的 *AIH* 基因共表达时，均检测到C44C积累。动力学分析显示，*P. aeruginosa* AIH对Agm的催化效率比对G44G高3倍，而 *R. wittichii* AIH对Agm无检测活性，特异性作用于G44G，其对G44G的催化效率比 *P. aeruginosa* AIH高13.5倍。研究人员提议将该酶命名为双胍丁胺亚胺水解酶（diagmatine iminohydrolase，DIH）。

**5. 高亚精胺生物合成中的新功能化鸟氨酸脱羧酶**

在编码HSS的若干细菌中，*hss* 基因与AR折叠ODC编码基因相邻，且某些物种中ODC基因上游存在 *speB* 基因。对 *Rhodopila globiformis*（HSS途径）和 *Rhodothalassium salexigens*（SpeY途径）的AR折叠ODC同源蛋白进行动力学分析，发现两者均对L-鸟氨酸无检测活性，而特异性作用于L-精氨酸，即已新功能化为精氨酸脱羧酶（ADC）。对照 *Brucella abortus* AR折叠ODC则仅对L-鸟氨酸有活性。这表明在SpeY和HSS途径中均存在ODC新功能化为ADC的情况。

**四、总结讨论与研究结论**

本研究证实，细菌Hspd生物合成存在两条截然不同的通路：依赖胍丁胺的SpeY途径与依赖腐胺的HSS途径，二者互斥。SpeY途径以Agm为底物合成G44G，再由特异性DUH或DIH将G44G分别转化为Hspd或C44C（后者可能由C44C酰胺水解酶进一步代谢）；而HSS途径直接利用Put合成Hspd。SpeY途径中的DUH和DIH对G44G具有严格底物特异性，不能作用于Agm，这保证了Agm不会被上游酶消耗，从而维持SpeY底物供应。相反，若SpeY单独转入仅编码经典胍丁胺酶的基因组，Agm将被水解为Put，SpeY将无法有效合成G44G。SpeY在细菌中的系统发育分布较HSS更广泛，可能反映了ADC途径在细菌各门中的分布远较ODC途径普遍。研究还发现，SpeY与AR折叠ODC共现仅限于α-变形菌门及γ-变形菌门的 *Coxiella* 属（包括Q热病原体 *C. burnetii*）。

研究结论：细菌高亚精胺生物合成通路完全分为依赖腐胺的HSS途径和依赖胍丁胺的SpeY途径两大类，二者互斥。胍丁胺不仅是SpeY合成G44G的直接底物，也参与N¹-氨丙基胍丁胺和羧基氨丙基胍丁胺等亚精胺生物合成通路，这凸显了胍丁胺在细菌多胺生物合成中的核心地位。该发现重构了对细菌多胺生物合成通路网络的传统认知——腐胺在多种细菌多胺生物合成通路中并非必需中间体，甚至可被完全绕过。