《Journal of Biological Chemistry》：M6PR/IGF2R double-knockout supplies therapeutic sources for mucolipidosis II and Niemann-Pick C2
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溶酶体贮积症（lysosomal storage disorders, LSDs）是一类难治性罕见疾病，主要由溶酶体酶基因缺陷导致溶酶体功能障碍所引起。多种溶酶体酶要正确转运至溶酶体，其经GlcNAc-1磷酸转移酶（GNPT）介导的甘露糖-6-磷酸（manno
溶酶体贮积症（lysosomal storage disorders, LSDs）是一类难治性罕见疾病，主要由溶酶体酶基因缺陷导致溶酶体功能障碍所引起。多种溶酶体酶要正确转运至溶酶体，其经GlcNAc-1磷酸转移酶（GNPT）介导的甘露糖-6-磷酸（mannose-6-phosphate, M6P）标记至关重要。M6P修饰的溶酶体酶被M6P受体捕获并转运至溶酶体。M6P依赖性通路不仅用于新合成的溶酶体酶，也用于外源性给予的溶酶体酶向溶酶体的细胞内转运。在本研究中，研究人员针对编码M6P受体的M6PR和IGF2R基因进行了基因敲除。这些基因双敲除的细胞将M6P修饰蛋白分泌至培养上清（dKO sup）中，研究人员探讨了其在治疗应用方面的潜力。I-细胞病（黏脂贮积症II型，mucolipidosis II, ML-II）由GNPT缺陷引起，是一种细胞内数十种溶酶体酶缺乏的疾病。用dKO sup处理ML II细胞可恢复溶酶体酶活性、减少包涵体并改善自噬功能。经该处理，ML II患者来源的成纤维细胞表现出溶酶体酶活性升高、形态正常化以及冻存存活率改善。NPC2蛋白并非溶酶体酶，但与NPC1蛋白协同介导溶酶体中的胆固醇转运。NPC2缺陷导致尼曼-匹克病C2型（Niemann-Pick disease type C2），dKO sup通过补充NPC2蛋白恢复了该疾病的细胞功能。这些结果表明，M6PR/IGF2R双缺陷细胞提供了一个简单的平台，用于供应M6P修饰蛋白，可应用于多种LSDs的治疗。
**一、研究背景与意义**
溶酶体是细胞内负责降解和回收蛋白质、脂质、碳水化合物及核酸等生物大分子的囊泡状细胞器，内含多种酸性水解酶。编码这些溶酶体酶的基因发生突变会导致降解活性下降，进而引发溶酶体贮积症（LSDs，一类因溶酶体功能障碍导致的难治性罕见遗传病）。酶替代治疗（ERT，通过输注重组酶以恢复细胞降解功能的方法）已在戈谢病、法布里病、庞贝病、溶酶体酸性脂酶缺乏症以及部分神经元蜡样脂褐质沉积症和黏多糖贮积症中建立。多数新合成的溶酶体酶需在高尔基体经UDP-N-乙酰葡糖胺-溶酶体酶N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶（GNPT）催化，在N-连接寡糖非还原端添加甘露糖-6-磷酸（M6P）标记，随后被反式高尔基体网络中的M6P受体捕获，经网格蛋白包被囊泡转运至溶酶体。GNPT功能缺陷导致M6P修饰受损，溶酶体酶被错误分选并分泌至细胞外。黏脂贮积症II型（ML II，又称I-细胞病）和III型由GNPT遗传缺陷引起，细胞内数十种溶酶体酶缺乏，未消化底物蓄积形成包涵体。尼曼-匹克病C2型由NPC2基因缺陷引起，该基因编码的NPC2蛋白与NPC1蛋白协同介导溶酶体内游离胆固醇的转运。这两种疾病并非单一的溶酶体酶缺陷，因此迄今尚未建立ERT等根本性治疗手段。为此，研究人员尝试通过基因敲除M6P受体，建立可持续分泌M6P修饰蛋白的细胞平台，为多种LSDs提供治疗来源。该研究由Toshiharu Fujita、Seigo Terawaki、Takahito Moriwaki、Takanobu Otomo完成，发表于《Journal of Biological Chemistry》。
**二、主要研究内容与结论**
研究人员利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术建立了M6PR和IGF2R双敲除（dKO）HeLa细胞。dKO细胞将M6P修饰的溶酶体酶大量分泌至培养上清（dKO sup）。用dKO sup处理GNPTAB敲除（KO）细胞和ML II患者来源皮肤成纤维细胞，可恢复溶酶体酶活性、减少包涵体、改善自噬功能、缓解胆固醇蓄积，并显著提高ML II细胞冻存后的存活率。此外，dKO sup所含M6P修饰的NPC2蛋白可被NPC2 KO细胞摄取并恢复其胆固醇转运功能。该平台为ML II等酶缺陷型LSDs及尼曼-匹克病C2型提供了新的治疗策略。
**三、关键技术方法**
研究人员采用CRISPR/Cas9技术在HeLa-Kyoto细胞中分别或组合敲除M6PR、IGF2R、GNPTAB、GNPTG、NAGPA、MAN2B1、FUCA1、GLB1、IDUA、HEXA、HEXB、LIPA、NPC1、NPC2等基因，各克隆经Sanger测序验证。主要检测方法包括：4-甲基伞形酮（4MU）荧光底物法测定胞内及培养上清的溶酶体酶活性；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析上清分泌蛋白谱；Western blotting结合Endo H/PNGase F糖苷酶处理检测酶蛋白加工与NPC2糖基化状态；LC3通量实验评估自噬功能；LysoTracker、Filipin III及SP
