基于在线综合二维液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（2DLC-Q-TOF-MS/MS）结合深度学习聚类驱动双模式采集技术的中药复方化学成分全局表征策略——以启神益气滴丸为例

《Journal of Chromatography A》：Global characterization strategy for chemical constituent of traditional Chinese medicine formulas based on online comprehensive 2DLC-Q-TOF-MS/MS combined with deep learning clustering driven dual-mode acquisition: a case study of Qishen Yiqi Dropping Pills

　　

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  开发了一种由深度学习聚类驱动的双模式采集策略。
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  深度学习辅助的质谱缺陷过滤（MDF）实现了对化学化合物的精确分类。
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  PyMassTime-Cluster系统促进了子优先离子捕获（sub-PIC）列表的生成。
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  实现了对芪参益气滴丸（QSYQDP）的全面智能化表征。

引言

中药方剂，包括中成药、经典方剂和医院制剂，在整体理论和辨证论治的指导下，长期以来一直为人类健康做出贡献[1]。然而，由多味药材配伍、多种炮制技术和煎煮方法所塑造的固有复杂性，导致中药方剂中具有极其复杂的化学组成[[2], [3], [4], [5], [6]]。因此，先进的分析技术对于全面表征复杂成分和阐明中药方剂的物质基础至关重要[7,8]。

液相色谱-质谱联用（LC-MS）以其高灵敏度、快速分析和优异分辨率的特点，已成为中药方剂高通量表征的广泛应用平台[9,10]。然而，传统的单维液相色谱由于严重的共洗脱和基质干扰，往往无法充分分离复杂混合物。二维液相色谱（2D-LC）通过将具有互补分离机制的色谱柱通过切换阀耦合在一起，克服了这些局限性，从而提高了峰容量和分离效率[6,[11], [12], [13], [14]]。因此，2D-LC已被应用于蛋白质、染料、聚合物和天然产物的分析[[15], [16], [17]]。在综合二维液相色谱中，第一维的馏分被连续收集到采样环中，并转移到第二维色谱柱进行进一步分离，从而实现了对样品组成成分广泛覆盖[[18], [19], [20]]。对固定相、梯度、调制条件和检测系统的持续优化，进一步增强了2D-LC在复杂中药方剂分离和表征中的应用性。

数据非依赖采集（DIA）和数据依赖采集（DDA）是质谱中的两大主要采集模式，其主要区别在于前体离子碎裂策略的不同[[21], [22], [23]]。在DIA中，所有位于预定义隔离窗口内的前体离子，无论其信号强度如何，都会被系统地碎裂，从而实现对MS/MS数据广泛且相对无偏的采集[24,25]。多窗口DIA通过缩小隔离窗口宽度来降低谱图复杂度和离子间干扰。相比之下，DDA根据实时信号强度选择前体离子进行MS/MS碎裂。在DDA中引入优先离子捕获（PIC）列表可以提高预定义目标离子的采集效率。然而，由于共洗脱前体离子之间的竞争，低丰度和微量成分可能仍然被遗漏。因此，完整的PIC列表可以进一步根据化合物类别和m/z-保留时间分布划分为子优先离子捕获（sub-PIC）列表，从而实现目标离子更精细、更高效的采集。因此，合理构建sub-PIC列表对于该策略的性能至关重要。

质谱缺陷过滤（MDF）利用化合物的质谱缺陷特征实现定向数据挖掘。近年来，开发了一系列MDF方法，包括离散MDF [26]、Kendrick MDF [27]、多窗口MDF [28]、多边形MDF [4]以及深度学习辅助MDF。其中，深度学习辅助MDF通过挖掘不同类型成分的质谱缺陷特征，可实现化合物的大规模分类和预测[29]。然而，同一化学类别中的化合物往往表现出相似的分子结构和色谱保留行为，这使得它们的MS/MS同时采集具有挑战性。因此，需要采用适当的策略来提高结构相关分析物的碎片离子采集概率。Scikit-learn是一个开源Python库，提供了广泛的机器学习算法和数据处理工具[30]。Scikit-learn基于Python构建数据模型，以满足研究人员多样化的处理需求。因此，基于Scikit-learn和Tkinter开发了PyMassTime-Cluster系统，用于对行为相似的离子进行预处理，以应对质谱中的同时检测问题。单一采集模式无法同时提供复杂中药体系中高丰度成分的全覆盖和低丰度成分的靶向检测。因此，需要多维采集和表征策略来克服这一局限性。

芪参益气滴丸（QSYQDP）是由黄芪根、丹参根及根茎、三七根及根茎和降香木组成的中药方剂。其传统功效为补气、活血、祛瘀、止痛[31]。自2003年经中国国家食品药品监督管理局批准以来，QSYQDP已被广泛应用于心血管疾病的治疗管理[32]。其化学组成高度复杂，包含黄酮类、皂苷类、苯丙素类、萜类、有机酸和氨基酸[33]。然而，其成分尚未得到全面表征，这限制了对其药效物质基础的进一步阐明。

本研究建立了一个在线综合二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱（2DLC-Q-TOF-MS/MS）平台，用于QSYQDP的深入表征。其核心方法学创新不在于现有分类或聚类算法的独立应用，而在于构建了一种以采集为导向的工作流程，将化学类别预测转化为可执行的质谱采集策略（图1）。首先使用深度学习辅助MDF根据质谱缺陷特征对前体离子进行分类。所得的分类离子随后在m/z-保留时间空间中由PyMassTime-Cluster系统进行处理，使高度共洗脱的离子被重新分配到均衡的sub-PIC列表中。与主要用于数据可视化或样本分类的常规聚类不同，聚类结果直接指导分步DDA采集，并结合动态排除和静态排除。进一步引入多窗口DIA来补充强度依赖的DDA数据，并改善碎片不足和低丰度离子的覆盖。最后，整合多数据库匹配、对照品比对、中性丢失分析、特征诊断离子、GNPS分子网络和CFM-ID预测进行结构注释。该分类-聚类-采集-注释工作流程解决了复杂多组分体系中因共洗脱和前体竞争导致的MS/MS覆盖不足问题，并为中药方剂的全面表征提供了一种可转移的分析策略。

章节片段

化学试剂与材料

QSYQDP由天士力制药有限公司（中国天津）提供。对照品购自成都德士特生物科技有限公司（中国成都），纯度不低于98%，包括芒萋素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芪甲苷IV、异黄芪甲苷Ⅱ、二氢丹参酮I、丹参酮IIA、丹酚酸D、三七皂苷R1、三七皂苷Fe、丹参酮I、丹酚酸E、黄芪甲苷II、黄芪甲苷III、隐丹参酮，

QSYQDP提取条件的优化

系统优化了包括溶剂类型、溶剂浓度和超声时间在内的提取参数。首先比较了甲醇和乙醇作为提取溶剂的效果，相应的离子分布图见图S1A。甲醇检测到最多的离子数，正离子模式下为1,930个离子，负离子模式下为3,000个离子（图S1B）。随后评估了含50%、75%和100%甲醇（v/v）的甲醇-水混合物。尽管

结论

建立了一种由深度学习聚类驱动的双模式采集策略，该策略基于在线综合2DLC-Q-TOF-MS/MS平台。整合深度学习辅助MDF和PyMassTime-Cluster系统生成sub-PIC列表，提高了低丰度和共洗脱化合物的碎片离子采集效率。利用该工作流程，在QSYQDP中表征了181种化合物，提供了一种实际的全面化学表征和药效

CRediT作者贡献声明

刘洋： 撰写-原始草稿、调查、方法论；杨曼： 方法论、调查、撰写-原始草稿、软件；秦涵： 方法论、调查；温佳科： 软件、方法论、调查；刘鹏： 方法论、调查；王晓燕： 方法论、概念化；杜坤泽： 撰写-审阅与编辑、监督、概念化、数据管理；常彦旭： 概念化、资金获取、项目管理、撰写-审阅与编辑。所有

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文章所报告的工作。

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作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究得到现代中药新质生产力科技创新专项（24ZXZKSY00030）、现代中药新质生产力科技创新专项（24ZXZKSY00010）以及天津市教育委员会高等教育科技发展基金（2024KJ016）的资助。

刘洋|杨曼|秦涵|温佳科|刘鹏|王晓燕|杜坤泽|常彦旭