《Advanced Science》：Predicting Single-Cell Perturbation Responses Across Biological Contexts With a Deep Generative Model Integrating Optimal Transport
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预测单细胞如何响应扰动是计算生物学中的一个核心问题，对新兴的人工智能虚拟细胞（AIVC）研究和药物发现工作具有潜在的相关性。然而，跨生物学情境的扰动响应存在显著差异，加之当前模型的泛化能力有限，使得跨细胞类型、患者、物种及其他情境的预测尤为具有挑战性。为应对
预测单细胞如何响应扰动是计算生物学中的一个核心问题，对新兴的人工智能虚拟细胞（AIVC）研究和药物发现工作具有潜在的相关性。然而，跨生物学情境的扰动响应存在显著差异，加之当前模型的泛化能力有限，使得跨细胞类型、患者、物种及其他情境的预测尤为具有挑战性。为应对这一挑战，研究人员提出了基于潜空间最优传输的单细胞扰动推断（scPILOT），这是一种查询条件化的框架，用于将先前观察到的扰动响应跨生物学情境进行转移。scPILOT通过判别器辅助训练学习生成式潜表征，并将扰动推断分离为从观察情境中进行的细胞层面响应估计和基于潜空间最优传输的查询特异性响应转移。在保留的细胞类型、患者和物种基准测试中，scPILOT分别取得了0.945/0.137、0.598/0.025和0.853/0.287的情境平均R2mean/MMD2值。此外，在保留的细胞系基准测试中，scPILOT保持了较强的群体平均准确性，而补充分析表明，其性能与数据集可学习性和查询-情境匹配度相关。随着单细胞扰动数据集的持续扩展，scPILOT可能为在日益多样化的生物学情境中转移先前观察到的扰动响应提供一个实用框架。
**论文解读文章**
**一、研究背景与现存问题**
近年来，单细胞测序技术的飞速发展使研究人员能够在单细胞分辨率下捕获基因组、转录组、表观基因组和蛋白质组信息，从而描绘细胞对扰动的响应。然而，由于扰动的高度异质性所导致的巨大组合空间以及细胞状态的复杂性，单细胞测序成本高昂且耗时。在某些情境下，例如研究富含细胞外基质而细胞稀疏的致密结缔组织（如软骨、肌腱和骨骼），制备高质量细胞悬液极其困难；或在涉及敏感个人生物信息的研究中，必须严格遵守隐私和数据安全要求，高通量筛选在技术上不可行或在实践/伦理层面受到限制。因此，利用日益丰富的单细胞测序数据进行计算机模拟扰动预测，已成为系统探索广阔假设空间的主流方法，并被视为人工智能虚拟细胞（AIVC）发展的关键要素，有望补充甚至部分替代传统实验方法，最终促进药物发现。
现有的单细胞扰动预测深度学习模型，通常采用自编码器（AE）加潜空间操作的架构。它们普遍假设扰动效应可以在细胞群水平上被捕获，即未扰动和扰动细胞基于细胞类型等群体特征进行匹配。然而，该假设忽略了群体内单个细胞的异质性。单细胞测序技术的内在限制（每个细胞在测量过程中通常被固定、染色或破坏）导致无法对同一细胞的扰动前后状态进行直接配对，因此扰动效应通常被估算为同一群体内未扰动和扰动细胞潜向量之间的平均差异。这种简化方式过度简化了单个细胞响应的变异性，削弱了模型跨不同生物学情境泛化的能力，导致其在应用于新数据时性能下降。此外，尽管最优传输（OT）已被用于推断未扰动和扰动细胞群之间的对应关系（如CINEMA-OT和CellOT），但在观察到的生物学情境内估算对照到扰动的映射，本身并不能决定如何将异质的扰动响应分配给仅提供未扰动状态的留出情境中的细胞。跨情境预测因此需要两种相关但不同的操作：从观察到的对照-扰动群体中估算细胞层面的扰动响应，以及根据基线细胞状态的相似性将这些响应转移到未扰动的查询群体。
**二、研究内容与结论**
为解决上述问题，研究人员提出了单细胞扰动推断via潜空间最优传输（scPILOT），一种查询条件化框架，用于跨生物学情境转移对先前观察到扰动的响应。scPILOT的核心方法学贡献在于其查询条件化的两阶段潜空间响应转移程序。第一阶段，潜空间最优传输从观察到的对照-扰动群体中估计细胞层面的扰动响应向量；第二阶段，根据查询群体（Q）与观察到的未扰动群体（ρU）之间的潜状态关系，将这些响应转移给单个查询细胞。Leiden聚类将该转移定位在转录组一致的邻域内，而自适应加权则根据查询特异性传输成本整合来自多个观察群体（ρU）的响应估计。该框架将扰动响应估计与局部查询特异性转移及多群体整合分离，而非依赖单一群体水平的位移或全局对照到扰动的映射。在该框架内，判别器辅助的特征匹配塑造了用于后续响应估计和转移的潜表征。在无判别器的情况下，优化更侧重于逐点重建目标，可能过度强调群体平均表达模式而牺牲异质的单细胞状态，导致预测响应过平滑，削弱对单细胞和细胞类型特异性异质性的保持。判别器辅助特征匹配通过引入额外的分布敏感约束，有助于缓解客观特异性过拟合，减轻相关的单细胞响应分布过平滑问题。
研究人员在四个生物学上不同的留出情境预测基准上评估了scPILOT与五个基线方法（scGen、CellOT、biolord、VAEGAN、identity）：使用Kang等人提供的含七种细胞类型经干扰素-β（IFN-β）刺激的人外周血单核细胞（PBMC）数据集的留出细胞类型预测；使用同一数据集的八个患者的留出患者预测；使用Hagai等人提供的四种物种（小鼠、猪、兔、大鼠）经脂多糖（LPS）刺激的骨髓来源单核吞噬细胞数据集的留出物种预测；以及使用Jiang等人提供的含六种癌症细胞系IFNGR2基因敲除数据集的留出细胞系预测。该研究发表于《Advanced Science》。
**三、关键技术方法**
研究人员为开展研究主要运用了以下关键技术方法：1）基于变分自编码器（VAE）的生成式表征学习，并结合判别器辅助的特征匹配与分类损失；2）潜空间最优传输（OT），使用POT库计算耦合矩阵，用于估计细胞层面的扰动响应向量；3）Leiden聚类算法，用于将查询群体和观察到的未扰动群体划分为转录组上更一致的亚群；4）基于平方2-Wasserstein距离和softmax变换的自适应权重计算，用于整合来自多个观察群体的响应估计。数据来源包括Kang等人（PBMC数据集）、Hagai等人（跨物种数据集）和Jiang等人（IFNGR2敲除细胞系数据集）。
**四、研究结果**
**scPILOT通过两阶段潜空间响应转移实现查询条件化扰动预测。** scPILOT包含生成式表征学习阶段和查询条件化推断过程。训练期间，编码器、生成器和判别器学习观察到的细胞状态的潜表征；推断期间，冻结已学习的神经网络参数，首先使用潜空间最优传输从观察到的未扰动和扰动群体估计异质的扰动响应，随后将这些响应转移到未扰动的查询细胞。Leiden聚类和自适应权重决定如何从多个观察群体转移和整合响应估计。研究人员将其与scGen、CellOT、biolord、VAEGAN和identity基线进行了比较。
**scPILOT与最先进模型在单细胞扰动预测中的性能。** 在Kang等人的PBMC IFN-β数据集上，每个细胞类型依次作为留出查询情境。scPILOT取得了最高的情境平均R2mean（0.945，其他最优为0.935）和最佳的实证最坏情况性能（0.914，其他最优为0.894）；同时取得了最低的情境平均MMD2（0.137，其他最优为0.149）和最佳的实证最坏情况性能（0.171，其他最优为0.231）。对于FCGR3A+Mono细胞，scPILOT也准确估计了ISG15和APOBEC3A等差异表达基因（DEG）的完整边际分布。CytoTRACE2分析表明，FCGR3A+Mono细胞处于分化下游阶段，而scPILOT能很好地刻画分化细节。
**scPILOT表征的不同细胞类型中常见标记基因与细胞类型特异性标记基因的差异响应。** 将基因表达整合到三类标记基因上：细胞类型特异性标记基因（如T细胞的CD3D，B细胞的CD79A）；IFN-β通用响应标记基因（如ISG15、IFI6、IFIT1）；以及细胞类型特异性IFN-β标记基因（如髓系细胞的CXCL10）。scPILOT在预测PBMC数据集中所有细胞类型时，均能准确预测常见标记物和细胞类型特异性标记物的响应。
**scPILOT与基线方法对未见患者的泛化能力。** 在Kang等人的PBMC数据集按患者样本ID注释的八个患者上，每个患者依次作为留出查询情境。scPILOT获得了0.598的情境平均R2mean（与CellOT相当），并展示了最佳的实证最坏情况R2mean；对于分布一致性，scPILOT取得了最低的情境平均MMD2（0.025）和最佳的实证最坏情况性能。与CellOT不同，scPILOT成功描绘了具有双峰形态的标记基因（如APOBEC3A和CXCL11）的边际分布。细胞类型分层评估显示scPILOT的优越性能在多种PBMC亚群中广泛保持。
**scPILOT与基线方法的跨物种扰动预测。** 在Hagai等人的四种物种经LPS刺激的数据集上，每个物种依次作为留出查询情境。scPILOT取得了最高的情境平均R2mean（0.853），并保持了一致的强预测准确性。对于MMD2，scPILOT取得了0.287的情境平均值，低于VAEGAN、scGen和biolord，但高于CellOT和identity。CellOT的低MMD2伴随明显更低的R2mean，表明其分布一致性优势并未转化为对群体平均基因表达的准确恢复。
**数据集与性能关系的分析。** 在Jiang等人的IFNGR2敲除六种癌症细胞系数据集上，每个细胞系依次作为留出查询情境。scPILOT在所有六个预测任务中保持了高R2mean，与identity和VAEGAN相当。对于MMD2，scPILOT显著优于biolord，与CellOT和scGen大致相当。通过量化数据集可学习性（扰动相关变异相对于生物学情境相关变异的比例），发现预测模型性能通常随数据集可学习性增加而提高，scPILOT在高可学习性基准上是最强的预测方法之一。查询-情境错配分析表明，预测性能更多地取决于可用观察情境与查询群体的相关性，而非用于推断的情境总数。
**scPILOT的组件级消融研究。** 在四个基准上比较了scPILOT与四个变体：移除判别器、移除潜空间最优传输、移除Leiden聚类和移除自适应权重。移除判别器导致R2mean增加但MMD2也显著增加，表明判别器在单细胞分布保真度和群体平均表达准确性之间引入了权衡，且在跨患者预测中按细胞类型评估时性能显著下降，表明判别器有助于捕获扰动响应中的细胞类型特异性异质性。训练曲线显示无判别器模型达到更低的训练重建MMD2但更高的验证重建MMD2，提示客观特异性过拟合。潜空间最优传输的贡献取决于情境，其在跨患者基准中贡献最为明显。Leiden聚类对总体群体水平指标影响有限，但在保留局部响应特异性方面作用显著，尤其是在跨患者基准的细胞类型分层评估中。自适应权重的移除在大多数情境中同时降低了R2mean并增加了MMD2，表明其对群体平均表达准确性和单细胞分布保真度均有贡献。
**五、总结与讨论**
讨论部分指出，scPILOT将扰动响应估计与局部查询特异性转移和多群体整合分离，优于群体水平位移或全局映射。判别器辅助特征匹配有助于缓解过度平滑。组件消融实验支持其功能解释，但效果具有度量依赖性和情境依赖性。scPILOT存在两个主要局限性：一是其性能依赖于可用观察到的未扰动群体能否充分代表查询群体中的细胞状态，对稀有或代表性不足的细胞状态性能可能受限；二是其目前处理的是对先前观察到的扰动的情境泛化，而非扰动身份泛化，无法直接预测在任何生物学情境中均未观察到的扰动。未来工作可结合多模态细胞测量和单细胞基础模型学习的表征，利用分子结构、功能注释或大规模扰动数据集衍生的扰动嵌入，实现跨生物学情境和扰动身份的联合泛化。研究结论部分指出：scPILOT提供了一种查询条件化方法，用于跨生物学情境转移对先前观察到的扰动的异质响应。判别器辅助特征匹配有助于缓解客观特异性过拟合和相关的过平滑。通过将细胞层面响应估计与局部查询特异性响应转移分离，该框架根据观察群体与查询群体之间的基线状态关系预测扰动状态。在可获得未扰动查询细胞和足够信息量的观察群体时，研究结果支持该方法在留出细胞类型、患者、物种和细胞系情境中的实用性。
