瓢鸡原始生殖细胞冷冻保存体系的建立及解冻后效果评估

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Establishment of a cryopreservation system and evaluation of post-thaw effects for Piao chicken primordial germ cells

　　

摘要

原始生殖细胞（Primordial Germ Cell, PGC）冷冻保存为保护濒危鸡遗传资源提供了一种替代策略；然而，关于品种特异性PGC解冻后稳定性的证据仍然有限。本研究评估了一种基于CO?独立培养基的两步溶液冷冻保存程序，用于保存来源于性腺的瓢鸡PGC，保存时间分别为3、6、9和12个月。通过形态学观察、过碘酸-希夫染色（periodic acid–Schiff staining, PAS）、台盼蓝排斥实验、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入实验、CCK-8分析、JC-1染色、实时荧光定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）、免疫荧光、流式细胞术及胚胎性腺归巢分析评估解冻后特性。冷冻保存的PGC在解冻后保持典型的圆形或椭圆形形态，并维持PAS阳性。解冻后死亡率保持较低水平（约4%–5%）。在死亡率、增殖相关或代谢参数以及所评估基因的表达方面均未检测到统计学显著差异（P > 0.05）。各评估组间的JC-1荧光模式在定性上相似。冷冻保存后仍可检测到DDX4和SSEA-1蛋白信号，胚胎水平性腺归巢阳性比例在新鲜组为70%，在冷冻12个月组为78%，两组间无统计学显著差异。这些发现为选定细胞和分子特征在所评估的12个月储存期内得以保留提供了初步证据。仍需更大规模的生物学样本量、对个体性腺内供体细胞数量和分布的定量评估、种系传递检测以及基因组和表观遗传稳定性评估。

瓢鸡原始生殖细胞冷冻保存体系的建立与解冻后效果评估——论文解读

**1. 研究背景与意义**

家禽遗传资源是生物多样性和国家粮食与育种安全的重要组成部分，为培育新畜禽品种、改良生产性状、增强抗病能力以及适应未来环境与气候挑战提供了宝贵的遗传材料。中国地方家禽品种经过长期的自然与人工选择，具有独特的遗传结构、环境适应性、抗病能力和肉质风味等经济重要性状。然而，集约化生产体系的扩张、高选择商业品种的广泛使用、无序杂交、传染病以及保护投入不足，导致许多地方家禽品种群体规模缩小、遗传渐渗、遗传多样性丧失和近交程度增加。因此，亟需采取将活体保种的原位保护与冷冻保存的迁地保护相结合的综合保护策略，以降低宝贵家禽遗传资源不可逆丧失的风险。

瓢鸡是原产于中国云南省普洱市的一种珍稀地方鸡种，其特征是无尾椎骨、无主尾羽和无尾脂腺，是一种独特的无尾遗传资源。该品种还具有耐粗饲、抗病力相对较强、肉质细嫩、风味独特等优良生产性状，具有重要的遗传、科学和经济价值。然而，其地理分布狭窄、有效群体规模有限、历史上因无序杂交造成的遗传渐渗以及对活体保种的依赖，使其易受遗传侵蚀。虽然已实施活体保种计划，但需要持续的资金和管理投入，且易受疾病暴发、意外损失、繁殖失败和渐进性近交的影响。因此，需要迁地冷冻保存作为活体保种的补充备份策略。禽类原始生殖细胞（PGCs）是种系前体细胞，可产生功能性精子或卵母细胞，并将供体来源的遗传信息传递给后代。与精液、体细胞和胚胎等常规生物材料相比，PGC具有多方面优势：精液冷冻保存仅保留父本基因组，无法保存母本特有的W染色体或母系遗传的线粒体DNA；体细胞虽保留二倍体核基因组，但利用冷冻体细胞重建完整禽类个体尚不现实；完整禽蛋或胚胎的冷冻保存在技术上因蛋黄结构大而困难。相比之下，PGC可从雌雄胚胎中分离、体外扩增和鉴定、液氮中储存，并可移植到受体胚胎中。结合种系嵌合体生产和育种，冷冻保存的PGC有助于恢复濒危或稀有鸡种群。研究表明已在多种中国地方鸡群体中建立了PGC系并成功冷冻保存，且通过移植和种系嵌合体交配实现了瓢鸡的再生，证实了基于PGC的保护策略对该品种的可行性。然而，关于瓢鸡PGC在特定储存期后解冻后细胞稳定性的系统信息仍然有限。

冷冻保存是禽类PGC长期储存和实际应用的关键步骤。慢速冷冻和玻璃化是两种主要的细胞保存方法。慢速冷冻通过逐渐降温以减少细胞内冰晶形成、渗透胁迫和膜损伤，因其操作简便、可重复性好且与常规冷冻储存设施兼容，仍广泛用于鸡PGC。玻璃化则使用较高浓度的冷冻保护剂和快速冷却形成玻璃态，但冷冻保护剂毒性和技术变异性可能限制其应用。已有研究表明冷冻培养基、冷冻保护剂组成、细胞系、性别、品种、培养历史和复苏条件均可能影响保存效果。此外，长期体外培养可能损害PGC质量和功能能力，培养超过约三个月的鸡PGC即使保持增殖和表达相关标记，其种系传递能力也可能下降。因此，当PGC用于种质保存时，应考虑培养时间、传代次数、性别、细胞系均质性和基因组稳定性。近期研究还强调需要对培养和冷冻保存后的PGC进行多维评估，仅靠标记物表达并不能完全证明细胞功能得到完整保存。

在此背景下，本研究针对瓢鸡PGC，采用基于CO?独立培养基的两步慢速冷冻程序，系统评估了不同储存时长（3、6、9、12个月）对其解冻后形态、活力、增殖相关特性、线粒体膜电位、凋亡相关基因表达、生殖细胞及干细胞相关标记物表达的影响，并通过胚胎血管注射评估了胚胎水平性腺归巢能力，旨在为瓢鸡PGC的长期冷冻保存提供品种特异性的基础数据。

**2. 主要技术方法**

研究人员利用江苏省家禽科学研究所提供的瓢鸡受精蛋孵化获取胚胎，并建立了来源于性腺的瓢鸡原始生殖细胞（PGC）系。冷冻保存采用基于CO?独立培养基、胎牛血清（FBS）和终浓度10%二甲基亚砜（DMSO）的两步慢速冷冻程序。解冻后评估涵盖以下技术：形态学观察、过碘酸-希夫（PAS）染色检测糖原含量、台盼蓝排斥实验检测细胞活力、EdU掺入实验和CCK-8实验检测细胞增殖、JC-1染色检测线粒体膜电位、实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测基因表达、间接免疫荧光和流式细胞术检测蛋白表达。此外，通过慢病毒载体建立GFP标记的新鲜和冷冻12个月PGC系，并进行胚胎血管注射以评估性腺归巢能力。

**3. 研究结果**

**3.1 解冻后瓢鸡PGC富含糖原**

研究人员在冷冻前对各组PGC进行形态观察和计数，所有组PGC均呈现典型的圆形或椭圆形形态，形态均匀，生长状态良好，细胞浓度均达到1×10?个/mL的冷冻保存数量要求。解冻后连续形态观察显示，第1天可见少量细胞碎片和个别非活力或形态异常细胞；第3天各组状态逐渐稳定，死亡细胞减少，聚集缓解，增殖活性启动；第5天完全进入稳定生长期，保持典型圆形或椭圆形且无聚集。PAS染色结果显示所有冷冻组解冻后PGC均呈强阳性反应，细胞质充满紫红色糖原颗粒，而鸡胚成纤维细胞（CEF）阴性对照组无着色反应，表明不同时长冷冻保存后瓢鸡性腺PGC仍稳定保留富含糖原的典型生物学特征。

**3.2 冷冻保存和解冻对瓢鸡PGC增殖状态的影响**

EdU掺入实验显示新鲜组和所有冷冻组均观察到清晰的EdU阳性红色荧光信号，EdU阳性细胞比例无统计学显著差异（P > 0.05）。CCK-8实验检测细胞代谢活性，各冷冻组与新鲜组的OD???值无显著差异（P > 0.05），而空白对照显著低于新鲜组（P < 0.001）。qRT-PCR检测增殖相关基因PCNA的表达，各组间无显著差异（P > 0.05）。结果表明所评估的增殖相关和代谢参数在冷冻保存后未检测到明显变化。

**3.3 解冻后细胞活力、线粒体膜电位及凋亡相关基因表达**

台盼蓝排斥实验显示新鲜组与各冷冻组间细胞死亡率无统计学显著差异（P > 0.05）。JC-1染色显示所有组以红色荧光为主、绿色荧光相对较弱，表明未检测到明显的线粒体膜去极化。qRT-PCR检测凋亡相关基因BAK1、BCL2和CASP3的表达，各组间均无统计学显著差异（P > 0.05）。

**3.4 瓢鸡PGC中生殖细胞、迁移及多能性相关标记物的表达**

qRT-PCR结果显示，新鲜PGC与解冻后PGC在生殖细胞特异性基因DDX4和DAZL、迁移基因CXCR4以及多能性基因OCT4和NANOG的表达水平上均无显著差异（P > 0.05）。间接免疫荧光检测显示，DDX4蛋白在各组中均呈现显著红色荧光信号，SSEA-1蛋白在各组中均呈现明显绿色荧光信号，平均荧光强度均无显著差异（P > 0.05）。流式细胞术进一步验证了上述蛋白表达结果，新鲜组与各冷冻组之间DDX4和SSEA-1的表达水平无显著差异。

**3.5 新鲜与冷冻12个月瓢鸡PGC的胚胎水平性腺归巢**

研究人员将GFP标记的新鲜和冷冻12个月PGC分别注射到胚胎第2.5天（E2.5）的受体胚胎血管中，在胚胎第5.5天（E5.5）分离性腺进行荧光检测。新鲜组共使用60枚受体蛋，成功注射44枚，检查时存活30枚，其中21枚性腺区域检测到GFP阳性细胞，性腺归巢阳性比例为70%。冷冻12个月组共使用60枚受体蛋，成功注射40枚，存活27枚，其中21枚性腺区域检测到GFP阳性细胞，性腺归巢阳性比例为78%。Fisher精确检验显示两组间无统计学显著差异（P > 0.05）。表明冷冻保存12个月的PGC在评估条件下仍保留到达受体性腺区域的能力。

**4. 讨论与结论**

研究人员指出，本研究的主要贡献不在于首次实现对瓢鸡PGC的冷冻保存或再生，而在于使用定义明确的两步冷冻程序评估了储存3、6、9和12个月后的选定解冻后细胞和分子特征。所使用的两步添加冷冻保护剂方法旨在减少DMSO的突然暴露和渗透压的骤变。在3至12个月的评估储存期内，该程序支持了瓢鸡PGC选定形态学、细胞学和分子学特征的保留。然而，研究人员强调了结果的谨慎解读：部分冷冻组仅包含两个独立建立的PGC系，且未进行前瞻性样本量或统计功效计算，因此P > 0.05仅表示在当前条件下未检测到差异，而非证明统计学等价性或完全没有冷冻保存效应。台盼蓝排斥实验仅评估膜完整性和活力，JC-1染色仅提供线粒体健康的局部评估，BAK1、BCL2和CASP3表达结果提供辅助分子信息而非凋亡缺失的直接证据。标记基因和蛋白的保留支持所选PGC相关表型的维持，但标记物表达本身不能确立完整的种系功能。胚胎血管注射分析基于胚胎水平GFP阳性细胞存在与否，未定量单个性腺内供体细胞的数量、密度和空间分布，也未评估配子形成和种系传递，因此不应被解释为迁移或定植能力的完全等同。未来需要更大规模的独立PGC系、定量供体细胞定植分析、种系嵌合体生产、繁殖试验和供体来源后代的验证。

在结论部分，本研究评估了使用定义明确的两步溶液慢速冷冻程序冷冻保存3、6、9和12个月的瓢鸡性腺来源PGC的解冻后特性。在四个评估的储存间隔中，解冻后的PGC在实验条件下保留了典型形态和PAS阳性、低死亡率、评估的增殖相关和代谢特征、JC-1荧光模式及选定的生殖细胞和干细胞相关标记物。此外，GFP标记的冷冻保存12个月的PGC保留了到达受体性腺区域的能力。冷冻12个月组的胚胎水平性腺归巢阳性比例为78%（21/27），新鲜组为70%（21/30），两组间无统计学显著差异。这些发现支持当前冷冻保存系统在瓢鸡PGC长期保存方面的潜力。该研究是一项正在进行的纵向冷冻保存监测计划的一部分，四个评估储存间隔获得的一致结果为该系统在瓢鸡种质保护中的多年持续评估奠定了基础。持续复苏监测及遗传和表观遗传质量评估、定量性腺定植、种系传递测试和供体后代验证将为其在长期家禽种质库和品种恢复中的未来应用提供必要支持。该论文发表在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》。