由俘获子（Captan）诱导的米根霉（Rhizopus oryzae）丙酮酸发酵：来自靶向代谢组学的机制见解

《Journal of Hazardous Materials》：Captan-induced pyruvic acid fermentation by Rhizopus oryzae: mechanistic insights from targeted metabolomics

　　

摘要

丙酮酸是制药和化工行业中的关键中间体，它作为连接多种细胞内途径的中心的代谢枢纽。生物合成丙酮酸具有环境和可持续性的优势。然而，丙酮酸的积累和分泌常常受到微生物代谢调节的限制。在这项研究中，使用外源性的邻苯二甲酰亚胺类抑制剂卡坦（captan）来调节Rhizopus oryzae中的丙酮酸代谢，导致在6毫克/升卡坦浓度下丙酮酸积累量达到1.15克/升。测量结果显示，丙酮酸脱氢酶（PDH）和丙酮酸羧化酶（PC）的活性显著下降。在10毫克/升卡坦浓度下，PDH和PC的活性分别降低了59%和56%，从而促进了丙酮酸的积累。基于核心碳的代谢组学分析鉴定了43种差异表达的代谢物，发现丙酮酸代谢途径受到抑制。能量代谢从三羧酸（TCA）循环转向了糖酵解。卡坦处理减少了R. oryzae的生物量积累，但其细胞超微结构未受影响。这些结果阐明了卡坦驱动的丙酮酸发酵机制，为丙酮酸生产的可持续废物转化为资源生物工艺奠定了基础。

引言

丙酮酸是一种广泛应用于制药、食品和化工行业的重要平台化学品。全球每年对丙酮酸的需求超过28万吨，并且持续稳定增长[1]。作为一种细胞代谢的中心中间体，丙酮酸在连接糖酵解、三羧酸（TCA）循环、氨基酸代谢和各种发酵途径中起着关键作用[2]。由于其重要的代谢作用和不断增长的工业需求，丙酮酸的可持续生产受到了广泛关注。

目前，丙酮酸的生产主要通过化学合成获得，这种方法会导致严重的环境污染和低底物利用效率。相比之下，生物技术生产被认为是一种有前景的替代方案，因为它成本较低且环保[3]。在环境污染工程领域产生的有机废物中含有大量的可生物转化的底物。然而，废物转化主要集中在生物燃料（如甲烷）和高价值生物聚合物（如聚羟基丁酸（PHB）[4]、[5]、[6]）上，而以丙酮酸为导向的废物转化研究则较少。在中国“双碳”政策的框架下，废物转化为丙酮酸的生物技术具有广阔的研究前景。本研究中使用了一种基于葡萄糖的合成发酵底物来代表有机废物中的碳水化合物部分，并研究了丙酮酸代谢的调控机制及其积累机制。

微生物具有复杂的代谢调控系统，在正常的微生物转化过程中，丙酮酸难以积累[7]。已有多种丙酮酸的生物合成途径被报道，包括Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径、Entner–Doudoroff（ED）途径、己糖单磷酸（HMP）途径以及葡萄糖的直接氧化[8]、[9]、[10]、[11]。在有氧条件下，丙酮酸主要通过丙酮酸脱氢酶复合物转化为乙酰-CoA，随后进入TCA循环；它也可以被羧化为草酰乙酸用于有机酸的生物合成[12]、[13]。在缺氧或厌氧条件下，丙酮酸主要被转化为乙醇、乳酸等发酵产物[14]、[15]、[16]。因此，有效调控丙酮酸代谢对于实现高效的丙酮酸发酵至关重要。

R. oryzae是一种具有重要工业价值的丝状真菌，因其强大的碳水化合物利用能力和高效的水解酶分泌能力而被广泛用于有机酸发酵[17]、[18]。此外，R. oryzae》还被用于固体废物的转化，将农业残余物和食品加工副产品转化为高附加值的化合物，如乳酸和富马酸[19]、[20]。在R. oryzae中，葡萄糖通过糖酵解代谢生成丙酮酸，丙酮酸进一步分流到多个下游途径，包括富马酸合成、TCA循环、乙醇生成和乳酸生产。在有氧条件下，丙酮酸可以通过丙酮酸脱氢酶复合物（PDH）转化为乙酰-CoA，随后进入TCA循环产生能量。或者，在缺氧条件下，丙酮酸可以通过丙酮酸羧化酶（PC）介导的草酰乙酸形成途径或转化为乙醇和乳酸等发酵产物（见图1）。由于丙酮酸通过这些竞争性途径迅速消耗，特别是在PDH介导的转化为乙酰-CoA的过程中，R. oryzae内的丙酮酸积累受到内在限制。因此，在丙酮酸代谢环节进行干预是实现丙酮酸积累的有效策略。

已经开发了几种策略来调控丙酮酸代谢并促进其积累。基因工程策略被用来破坏丙酮酸的分解代谢途径，从而促进丙酮酸的积累。Tomar等人（2003年）删除了编码PDH复合物成分的aceE、aceF和lpd基因，从而得到了一种能够在35小时内利用葡萄糖和乙酸作为底物积累35克/升丙酮酸的菌株[21]。随机突变方法也被用来分离缺乏辅因子生物合成的营养缺陷突变体，从而实现丙酮酸的生产。Kamzolova培养了一种硫胺素依赖的Blastobotrys adeninivorans菌株（VKM Y-2677），该菌株在葡萄糖发酵过程中产生了43.2克/升的丙酮酸[22]。在硫胺素受限条件下，PDH活性降低，促进了丙酮酸的外排。尽管这些方法有效增强了丙酮酸的产生，但基因操作需要复杂的菌株构建，而营养调控依赖于精确控制的培养条件。此外，还设计了针对PDH的抑制剂并应用于各种生物过程中。Song等人（2017年）在发酵微生物中使用了PDH复合物抑制剂，证明了PDH抑制改变了细胞内碳代谢，减少了乙酸和丁酸等代谢副产物的产生[23]。这些发现表明PDH是控制丙酮酸衍生代谢流的关键节点，尽管其用于促进丙酮酸积累的应用尚未得到探索。相比之下，小分子抑制剂提供了一种更直接和操作更灵活的方法，因为它不需要复杂的基因工程。

卡坦是一种广谱邻苯二甲酰亚胺类杀菌剂，被广泛用于控制苹果等作物中的真菌疾病[24]。据认为，卡坦可能通过干扰PDH复合物中E₁亚单位的硫胺素二磷酸（ThDP）依赖的催化机制来改变其活性。由于ThDP是E₁亚单位的必需辅因子，破坏这种辅因子的结构会显著损害PDH的脱羧活性。卡坦可以改变真菌培养物中的有机酸组成，表明其作为代谢调控化学抑制剂的潜力[25]、[26]、[28]。到目前为止，还没有研究利用卡坦来干扰丙酮酸代谢以实现其积累，也没有阐明卡坦驱动的丙酮酸积累机制。

为了调节R. oryzae中的丙酮酸代谢，使用了外源性的邻苯二甲酰亚胺类抑制剂卡坦来诱导丙酮酸积累。阐明了R. oryzae在卡坦作用下的发酵状态，并量化了参与卡坦诱导的丙酮酸调节的关键酶活性。进行了靶向代谢组学分析，研究了核心代谢物及其相关代谢途径的细胞内变化。这些结果为实现以丙酮酸为产品的废物转化奠定了基础。

章节片段

菌株培养和孢子制备

本研究使用了R. oryzae（中国Angel Yeast有限公司）。该菌株在37°C下于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上活化并培养以产生孢子。PDA培养基的组成见表S1。使用无菌0.01%（v/v）吐温溶液从新鲜生长的PDA平板上收集成熟孢子，然后用无菌纱布过滤以去除菌丝碎片。孢子浓度通过

丙酮酸的生产

丙酮酸是R. oryzae代谢网络中的核心枢纽。在正常生理条件下，丙酮酸通常不会积累，因为其细胞内水平受到其生物合成和多种下游代谢途径快速转化的协调调控。富马酸是R. oryzae的主要代谢产物[30]。引入卡坦后，富马酸的积累显著减少到0.27克/升

结论

卡坦有效地调控了丙酮酸代谢，导致丙酮酸积累。测量的PDH和PC活性显著下降。靶向代谢组学分析表明，丙酮酸的核心代谢途径受到调节，能量代谢过程发生了重组。这些结果展示了卡坦对R. oryzae中丙酮酸发酵的影响。此外，还阐明了卡坦驱动的丙酮酸积累机制

环境影响

研究表明，卡坦可以有效地调节R. oryzae中的丙酮酸代谢。靶向代谢组学揭示了碳代谢的协调变化，表明卡坦引发了代谢响应。尽管卡坦有效改变了丙酮酸代谢，但由于其杀菌活性和对非目标生物的潜在毒性，应仔细考虑其环境影响。特别是，残留物的浓度

重要性声明

研究表明，卡坦可以有效地调节R. oryzae中的丙酮酸代谢。靶向代谢组学揭示了碳代谢的协调变化，表明卡坦引发了代谢响应。这种调控策略被建议作为提高增值化学品选择性生产的潜在方法。这些发现为将这种方法扩展到富含碳水化合物的有机物提供了理论基础

CRediT作者贡献声明

Da Kang：写作 – 审稿与编辑。Ru Wang：写作 – 审稿与编辑、监督、资源管理。Yifan Niu：写作 – 初稿撰写、数据整理。Mark C.M. van Loosdrecht：写作 – 审稿与编辑。Ping Zheng：写作 – 审稿与编辑。Caihong Qin：软件支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号52570090）的支持。

Yifan Niu|Ru Wang|Da Kang|Caihong Qin|Ping Zheng|Mark C.M. van Loosdrecht

西安建筑科技大学环境与市政工程学院，中国西安，710055