《Journal of Invertebrate Pathology》：Comparison of different matrices for the detection of honey bee pathogens: Results from a Norwegian study
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使用三种不同样品基质对蜜蜂蜂群进行了病原体筛查。蜂巢碎屑易于处理，适用于检测微孢子虫属（Nosema）和子囊菌属（Ascosphaera）病原体。蜜蜂样本最适合检测Lotmaria passim。蜂蜜中的检测灵敏度较低，且处理困难。所有样本对Acarapis
使用三种不同样品基质对蜜蜂蜂群进行了病原体筛查。蜂巢碎屑易于处理，适用于检测微孢子虫属（Nosema）和子囊菌属（Ascosphaera）病原体。蜜蜂样本最适合检测Lotmaria passim。蜂蜜中的检测灵敏度较低，且处理困难。所有样本对Acarapis woodi和Crithidia mellificae均为阴性。
**论文解读：《不同基质在蜜蜂病原体检测中的比较：一项挪威研究的结果》**
蜜蜂作为重要的传粉昆虫，其健康状态对农业生态系统和养蜂业的经济效益具有至关重要的影响。病原体的检测与鉴定是疫病防控的基础环节，目前常用的检测方法包括病原体分离培养、肉眼或显微镜下形态学观察以及分子生物学检测等。针对不同病原体，研究人员通常会选择不同的检测基质，例如蜂巢碎屑、成年工蜂、巢脾甚至是蜂蜜。近年来，利用蜂蜜进行病原体DNA检测被认为是一种极具潜力的非侵入性采样方式，并已有研究从蜂蜜中成功检出美洲幼虫腐臭病病原（Paenibacillus larvae）、欧洲幼虫腐臭病病原（Melissococcus plutonius）、微孢子虫（Nosema apis和Nosema ceranae）以及蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）等多种病原体。然而，大多数先前的研究仅验证了在蜂蜜中检出病原体的可行性，并未将其与蜜蜂样本、巢脾或蜂巢碎屑等传统检测基质的检测效能进行系统性比较，这使得蜂蜜作为常规诊断基质的适用性尚不明确。
针对上述研究空白，来自挪威生命科学大学兽医学院的研究人员开展了一项比较研究，旨在系统评估三种不同采样基质——蜂蜜、成年蜜蜂和蜂巢碎屑——对六种重要蜜蜂病原体的检出效能。该研究选取的六种病原体包括：气管螨（Acarapis woodi）、白垩病病原真菌（Ascosphaera apis）、两种锥虫科寄生虫（Crithidia mellificae和Lotmaria passim）以及两种微孢子虫（Nosema apis和Nosema ceranae）。研究样本采集自挪威南部（北纬63°以南）15个蜂场的40个蜂群，采样时间为2023年6月至10月。研究者不仅比较了不同基质中病原体的检出率，还分析了定量PCR（qPCR）循环阈值（Cq值）所反映的病原体DNA含量差异，并从实验室操作层面评估了各基质在处理便利性方面的优劣。该研究论文发表在《Journal of Invertebrate Pathology》。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术手段：首先，在样本采集环节，通过与挪威养蜂人协会合作招募养蜂人，从每个蜂群分别采集100 mL蜂蜜、100只成年蜜蜂和2汤匙蜂巢碎屑，所有样本均来自挪威南部地区的15个蜂场；其次，在核酸提取环节，使用DNeasy Plant Pro Kit（Qiagen）并特别增加了珠磨匀浆步骤，以有效破碎微孢子虫厚壁孢子，蜂蜜样本则在提取前经过加热、离心等预处理以去除抑制物；第三，在病原体检测环节，采用已发表的引物探针和商业试剂盒进行多重实时荧光定量PCR（qPCR），并以膜翅目18S rRNA基因作为内参对照；此外，对于A. woodi和Nosema spp.，研究人员还分别采用胸片法和光学显微镜法进行了形态学检查，并与qPCR结果进行了对比验证。
研究结果部分主要包括以下三个方面的发现。在蜂场水平病原体流行情况（3.1小节）方面，所有15个蜂场的样本均未检出A. woodi和C. mellificae，而A. apis在所有蜂场中均有检出，表明该病原体在挪威南部蜂场中广泛存在。Nosema属微孢子虫也较为常见，其中N. apis的检出率（57%-73%蜂场阳性）显著高于N. ceranae（13%-36%蜂场阳性），这一差异在蜜蜂样本（p=0.027）和蜂蜜样本（p=0.021）中均具有统计学意义。L. passim在5个（33%）蜂场的蜂蜜样本和3个（20%）蜂场的蜜蜂样本中被检出，但所有蜂巢碎屑样本均为阴性。在蜂群水平配对样本比较（3.2小节）方面，McNemar检验结果显示，对于A. apis和N. apis，三种基质的检出率无显著差异；对于N. ceranae，蜂巢碎屑的检出率显著高于蜂蜜（p=0.013）；对于L. passim，蜜蜂样本的检出率显著高于蜂巢碎屑（p=0.041）。进一步对Cq值进行分析发现，蜂巢碎屑中A. apis（p<0.004）和N. apis（p=0.004）阳性样本的Cq值显著低于蜂蜜和蜜蜂样本，表明蜂巢碎屑中病原体DNA的相对含量更高。在显微镜与qPCR结果比较（3.3小节）方面，来自A. woodi风险区域附近两个蜂场的蜜蜂样本经显微镜检查均为阴性，与qPCR结果一致；而对于Nosema spp.，41个蜂群中仅有2个（5%）蜂群通过显微镜检出孢子，而qPCR检出率高达54%，表明显微镜法的灵敏度远低于qPCR，且无法区分N. apis和N. ceranae两种微孢子虫。
在讨论部分，研究人员指出，蜂巢碎屑作为一种非侵入性采样基质，具有采集方便、操作简单等优势，但在均质化和PCR抑制剂去除方面存在一定挑战。本研究表明，蜂巢碎屑在检测白垩病病原A. apis和Nosema属微孢子虫方面具有较高的灵敏度和较低的Cq值，尤其适用于N. ceranae的监测。然而，对于L. passim这一肠道寄生虫，蜂巢碎屑并不适用，蜜蜂样本才是最佳检测基质。蜂蜜虽然能够检出全部四种在研究中发现的病原体，但其粘稠的物理特性增加了前处理难度，且检出灵敏度和病原体DNA含量均低于蜂巢碎屑和蜜蜂样本。此外，研究还发现显微镜法在Nosema检测中的灵敏度严重不足，超过91%的qPCR阳性蜂群无法通过显微镜确认。在流行病学层面，A. apis在挪威南部蜂场的高检出率支持该病原体在潮湿寒冷气候条件下广泛分布的既往观点；N. apis在挪威仍占主导地位，这与大多数欧洲国家以N. ceranae为主的情况有所不同，可能反映了N. apis在寒冷气候下更强的生存适应能力；L. passim的低检出率则为挪威首次报道的该类寄生虫流行数据提供了基线参考。研究结论强调，蜂巢碎屑是检测Nosema spp.和A. apis的最优基质，兼顾了灵敏度高、操作简便和非侵入性的优点，可能不适用于L. passim检测，而蜜蜂样本是后者的首选基质。同时，该研究也指出，A. woodi和C. mellificae在挪威蜂场中可能已经极为罕见或不存在，但由于样本量有限且采样区域局限于挪威南部，不能完全排除低水平流行或局部暴发的可能性。研究者建议未来应在挪威全国范围内开展基于风险抽样的系统监测，并采用高灵敏度的分子检测方法，以准确掌握蜜蜂病原体的流行态势，为养蜂业提供科学有效的防控建议。
