水合可调油包离子液体微乳用于增强高分子量蛋白质透皮递送

《Journal of Molecular Liquids》：Hydration-tunable ionic liquid-in-oil microemulsions for increased transdermal delivery of high-molecular-weight proteins

　　

•水合[Cho][Pro]离子液体使大分子蛋白质的有效增溶成为可能。
•蛋白质二级结构在水合离子液体中得到保留。
•HIL/O微乳形成了稳定且尺寸为30–50 nm的纳米液滴。
•与PBS对照组相比，经皮蛋白质渗透增加了高达62倍。
•HIL/O微乳为高分子量蛋白质递送提供了一种非侵入性平台。

水合可调油包离子液体微乳用于增强高分子量蛋白质透皮递送的研究解读

一、研究背景与目的

透皮给药是一种非侵入性的传统给药途径替代方案，具有改善患者依从性、避免首过代谢和实现可控治疗释放等明确优势，这些优势已推动小分子药物透皮递送系统研究取得大量成功并催生多种商业产品。然而，由于高分子量蛋白质分子尺寸较大、亲水性高，且高度有序的角质层(SC)脂质结构对蛋白质渗透构成限制，实现其经皮递送仍面临严峻挑战。尽管化学渗透增强剂、纳米载体系统以及微针、离子导入、激光消融和超声等物理技术已得到探索，但这些方法存在侵入性或制剂复杂性等局限，亟需进一步优化以提高递送效率和生物相容性。

基于离子液体(IL)的微乳系统因其热力学稳定性、纳米级液滴结构及与皮肤的相互作用而被视为新一代透皮递送平台，将IL整合至微乳可提供可调溶剂环境和调节皮肤渗透性等额外功能。其中，生物相容性胆碱基IL在提高药物增溶和皮肤渗透方面展现出潜力。然而，由于低水合IL环境常与高分子量蛋白质的结构要求不相容，IL基微乳此前仅局限于小分子药物和多肽的递送，对于分子量超过约45 kDa的完整未修饰蛋白，经IL基微乳递送尚无报道。为此，研究人员提出采用水合控制的IL体系以增强蛋白质相容性，但将水合IL系统协同整合至微乳透皮平台用于高分子量蛋白质递送的研究仍近乎空白。

本研究旨在开发一种水合油包离子液体(HIL/O)微乳平台，以卵清蛋白(OVA, 约45 kDa)和牛血清白蛋白(BSA, 约66 kDa)作为模型蛋白，系统评价该平台在经皮递送高分子量蛋白质方面的可行性。

二、研究方法概览

研究人员合成并优化了水合度为45 wt%的生物相容性胆碱丙酸离子液体([Cho][Pro])，以实现模型蛋白增溶并保持其二级结构；随后以表面活性离子液体胆碱亚油酸([Cho][Lin])为主表面活性剂，Span 20和聚乙二醇400(PEG 400)为助表面活性剂，肉豆蔻酸异丙酯(IPM)为油相，构建HIL/O微乳。研究采用圆二色(CD)光谱评估蛋白结构完整性，采用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)表征液滴尺寸、分布和形貌，采用Franz扩散池法在离体小鼠和尤卡坦微型猪(YMP)皮肤（购自Charles River Japan）上考察体外透皮渗透和皮肤滞留，利用傅里叶变换红外(FTIR)光谱分析角质层脂质结构变化，并通过CCK-8法和组织学染色评价细胞相容性和皮肤完整性。

三、研究结果

（一）高分子量蛋白质在水合IL中的溶解性及其结构稳定性

研究显示，在含水量仅为10–13 wt%时，OVA和BSA在[Cho][Pro] IL中不溶解并形成浑浊分散体；当含水量提升至40 wt%以上时，两种蛋白质均形成澄清均一溶液，表明存在高分子量蛋白质在IL体系中增溶的关键水合阈值。基于此，研究人员选择45 wt%水合度的[Cho][Pro] IL作为最佳蛋白质相容介质。CD光谱分析表明，经45%水合[Cho][Pro] IL处理后并透析去除IL后，两种蛋白的CD谱图与在PBS中溶解的对照蛋白高度一致，OVA的正峰约192 nm和负峰约221 nm以及BSA在210–225 nm区域的典型α-螺旋特征均得到保留，说明水合IL暴露不会引起蛋白质二级结构的不可逆改变。

（二）HIL/O微乳的物理化学表征

研究通过引入6.0 wt% PEG 400作为助表面活性剂，获得了光学透明均一的微乳制剂。DLS测定结果表明，空白HIL/O微乳的平均粒径为25.11 nm，OVA负载HIL/O微乳为44.37 nm(PDI 0.135)，BSA负载微乳为31.49 nm(PDI 0.126)，均呈现窄尺寸分布且PDI小于0.2，表明蛋白质成功封装于水合IL分散相中。经30天室温储存，制剂仍维持在纳米尺度范围，未出现微观相分离或聚集，TEM观察也证实了稳定的微乳形态，表明该系统具备良好的短期胶体稳定性。

（三）体外皮肤渗透和滞留研究

定量经皮渗透研究显示，PBS对照组中OVA和BSA经小鼠和YMP皮肤的渗透量可忽略不计，确认了角质层的屏障功能。而在HIL/O微乳处理组中，小鼠皮肤上OVA和BSA的累积渗透量分别为16.03和17.94 μg/cm2，较PBS对照组分别提高约62倍和46倍；在更接近人体皮肤屏障特性的YMP皮肤中，OVA和BSA的渗透量分别为10.39和8.19 μg/cm2，较对照组提高约35倍和22倍。皮肤滞留方面，小鼠皮肤中OVA和BSA的滞留量分别为2.88和3.69 μg/cm2，滞留-渗透比分别为0.18和0.21，表明大部分蛋白可穿过较薄且渗透性较高的小鼠皮肤；而YMP皮肤中滞留量分别为23.11和37.68 μg/cm2，滞留-渗透比达2.22和4.60，反映了YMP皮肤较强的屏障特性倾向于使蛋白暂时滞留于组织内。共聚焦激光扫描显微镜观察进一步证实，经HIL/O微乳处理的YMP皮肤在表皮深层和真皮层出现强烈荧光信号，而PBS处理组皮肤荧光主要局限于浅表角质层，证实了微乳显著增强了蛋白的皮肤渗透和滞留。

（四）经SC片段的FTIR分析阐明皮肤渗透机制

FTIR光谱分析显示，未处理角质层样品的CH?对称和不对称伸缩振动峰分别位于2851和2918 cm?1，表明脂质呈高度有序的紧密堆积构象；而经OVA和BSA负载HIL/O微乳处理后，两峰分别迁移至约2854和2924 cm?1，反映脂质烷基链流动性和无序性增加，即SC脂质构象向gauche构象转变，降低了堆积密度并扰乱了层状结构。两种蛋白负载制剂效果相似，说明渗透增强主要由制剂辅料组成驱动而非负载蛋白本身。

（五）体外细胞毒性评价

CCK-8法测定结果显示，在蛋白等效浓度12.5、25和50 μg/mL范围内，OVA和BSA负载HIL/O微乳处理HeLa细胞24 h后，细胞存活率均保持85%以上，并呈现非统计学显著浓度依赖性降低趋势，表明制剂具有可接受的体外细胞相容性，这归因于胆碱基IL和非离子表面活性剂等生物相容性组分的选择。

（六）皮肤完整性的组织学评价

组织学分析采用苏木精-伊红(H&E)染色观察YMP皮肤在制剂处理24 h后的结构变化。与PBS阴性对照类似，OVA和BSA负载HIL/O微乳处理后的皮肤组织显示完整的角质层、活性表皮和真皮结构，未见皮肤层分离或其他结构损伤迹象；而5% SDS阳性对照处理皮肤出现角质层破坏和真皮组织紊乱，验证了模型的有效性。结果表明HIL/O微乳在实验条件下具有良好的离体皮肤相容性。

四、讨论与结论

本研究开发了一种用于高分子量蛋白质透皮递送的HIL/O微乳平台。通过优化[Cho][Pro] IL水合水平，实现了OVA和BSA的增溶并确认其天然样二级结构可在去除IL基质后恢复，证明充分水合对IL体系中高分子量蛋白质相容性的决定性作用。HIL/O微乳体系形成了30–50 nm且尺寸分布狭窄的稳定纳米液滴；与PBS对照相比，制剂在小鼠和YMP皮肤上分别将蛋白经皮渗透量提高至62倍和35倍。机制研究表明，制剂通过改变角质层脂质组织并增加脂质流动性来实现渗透增强，该效应主要由[Cho][Lin]等辅料组分驱动。制剂展现出良好生物相容性，维持85%以上细胞存活率，且在测试条件下未对YMP皮肤造成可观察的组织学损伤。综上所述，HIL/O微乳平台克服了高分子量蛋白质递送中的关键瓶颈，为非侵入性透皮递送大分子治疗药物和疫苗提供了有前景的技术途径。