[3H]JNJ-64413739结合嘌呤能P2X7受体（P2X7R）在大鼠海藻酸脑内注射诱发癫痫持续状态后的空间与时间变化

《Journal of Neuroimmunology》：Spatial and temporal changes in [3H]JNJ-64413739 binding to purinergic P2X7 receptor (P2X7R) after status epilepticus induced by intracerebral kainic acid in the rat

　　

摘要翻译
[3H]JNJ-64413739能够特异性地与嘌呤能P2X7受体（P2X7R）结合，并在大鼠脑内达到饱和。癫痫持续状态（status epilepticus, SE）后，P2X7R结合以区域和时间依赖的方式增加。在慢性癫痫期间，所检测的所有脑区中P2X7R结合均保持升高。P2X7R是连接早期癫痫发作与持续性神经炎症及癫痫发生的生物标志物。

论文解读文章

**研究背景与科学问题**

癫痫是一种常见的神经系统疾病，全球至少有7000万人受其影响，其主要特征为自发性反复发作（spontaneous recurrent seizures, SRS）。尽管多数患者的症状在临床上可通过药物控制，但仍有约三分之一的患者发展为耐药性癫痫，其耐药机制目前尚不明确。临床和实验证据表明，神经炎症可能参与癫痫的病理生理过程。在啮齿动物模型中，海藻酸（kainic acid, KA）诱发的癫痫持续状态（status epilepticus, SE）可迅速增加多个脑区内促炎细胞因子（包括白介素-1β（IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））的mRNA表达，其中IL-1β在慢性期仍维持升高。然而，神经炎症发生的时间与癫痫发作扩散之间的精确关系，以及这些过程起源和扩散的具体脑区，尚未被明确界定，这限制了对炎症过程在癫痫发展中作用的理解。

三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）及其嘌呤能2×7受体（P2X7R）被认为在癫痫中发挥重要作用。P2X7R拮抗剂（如A-438079、亮蓝G（BBG）和JNJ-47965567）已在癫痫临床前模型中显示出治疗潜力。已有研究利用免疫检测或PET成像证明SE后海马区P2X7R表达升高，但对于癫痫发生过程中P2X7R的空间分布及其从潜伏期向癫痫状态转变的动态变化，尚缺乏系统研究。由于P2X7R在不同物种间存在显著的药理学差异，本研究首先在大鼠脑中验证了[3H]JNJ-64413739作为P2X7R放射性配体的适用性，随后利用体外放射自显影技术，系统评估了SE后急性期、潜伏期和慢性期多个脑区P2X7R结合的时间与空间变化。

**研究内容**

研究人员利用成年雄性Sprague-Dawley大鼠，通过立体定向注射海藻酸至右侧背侧前海马诱发SE，分别于SE后第1、3、5天（急性期）、第10、30天（潜伏期）和第60、90天（慢性期）取脑，采用[3H]JNJ-64413739体外放射自显影技术检测P2X7R结合密度。假手术对照组注射等体积生理盐水。饱和实验和置换实验用于验证配体的亲和力与特异性。定量分析在海马整体及其亚区（CA1、CA3、齿状回）、颞叶皮层、梨状皮层、丘脑、下丘脑和胼胝体等多个感兴趣区（ROIs）进行，数据以平均光密度转换为放射性结合值（fmol/mg组织当量）。

**主要技术方法**

本研究使用的主要技术包括：（1）饱和结合实验，测定配体平衡解离常数（K_D）以验证结合亲和力；（2）竞争置换实验，使用结构不同的P2X7R配体JNJ-47965567验证结合特异性；（3）体外放射自显影结合磷屏成像系统定量分析，结合标准曲线将光密度值换算为结合密度；（4）统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Student's t检验比较不同时程和左右半球的差异。大鼠样本来源于土耳其伊兹密尔爱琴大学动物设施。

**主要研究结果**

**[3H]JNJ-64413739在大鼠脑中的饱和与置换研究**：研究首先对[3H]JNJ-64413739在大鼠脑中的结合特性进行了验证。饱和实验显示该配体在大鼠脑内呈现浓度依赖性饱和，特异性结合在约10 nM浓度时达到完全饱和。以冷配体JNJ-64413739置换时，K_D = 2.4 nM（95% CI: 1.4–4.0 nM）；以JNJ-47965567置换时，K_D = 2.9 nM（95% CI: 1.7–5.0 nM）。置换实验表明，JNJ-47965567在浓度达到1 μM时可使[3H]JNJ-64413739的结合被完全置换，计算所得IC₅₀为59.4 nM（95% CI: 44.9–79.2 nM）。这表明[3H]JNJ-64413739在大鼠脑内具有高亲和力和高特异性，适用于P2X7R的定量检测。

**海马中的[3H]JNJ-64413739结合变化**：研究人员对海马整体及其亚区（CA1、CA3和齿状回）的P2X7R结合进行了定量分析。结果显示，所有亚区的结合水平在急性期逐渐升高，至10天时降至低谷，然后在第30天再次显著升高，此时海马整体结合超过对照值140%以上，CA1超过220%，CA3超过170%，齿状回超过60%。在慢性期（60–90天），结合水平稳定并可能略有下降，尤其在CA1区域。值得注意的是，海马整体在慢性期才出现注射同侧与对侧之间结合水平的显著差异，这是全脑唯一表现出左右半球不对称的脑区。

**大脑皮层中的[3H]JNJ-64413739结合变化**：颞叶皮层的结合水平在急性期略有升高，10天时回落至基线，30天时再次显著升高并达到对照的约2倍，且在整个慢性期维持高结合强度。与颞叶皮层不同，梨状皮层的结合特征截然不同：在30天前一直维持在无法与基线区分的低水平，而在第30天出现超过2倍的双侧显著升高，之后又急剧回落到基线并维持至90天。

**皮层下区域的[3H]JNJ-64413739结合变化**：丘脑和下丘脑的结合在急性期持续升高，第10天回落。在丘脑，第30天结合水平较基线显著增加80%，较第10天增加110%；下丘脑的变化模式与丘脑相似但幅度较小。胼胝体的时间变化模式与其他区域不同，其结合在30天后仍持续上升，到第60天才达到峰值，此时较基线显著增加160%。

**结论**

本研究提供了[3H]JNJ-64413739结合P2X7R在大鼠癫痫发生全过程（急性期、潜伏期和慢性期）的详细时间与空间图谱。研究得出三点重要结论：第一，SE后P2X7R结合不仅限于KA注射部位，而是在急性期数天内扩散至全脑多个区域；第二，海马区P2X7R升高可持续至SE后90天（本研究终点），而皮层和皮层下区域在10天短暂回落后再次显著升高；第三，梨状皮层在自发癫痫发作开始出现的时间点（约30天）表现出显著的P2X7R升高，提示P2X7R参与潜伏期向慢性期过渡中的关键病理过程。此外，胼胝体（白质区域）在慢性期（60天）出现继发性升高，提示少突胶质细胞或小胶质细胞参与了SE后长期的重塑性改变。这些发现表明，P2X7R结合在癫痫发作后发生持续性的时间和空间依赖性变化，是连接早期癫痫发作与持续性神经炎症及癫痫发生的潜在生物标志物，为P2X7R作为神经炎症成像靶点和治疗干预靶点提供了依据。该研究发表在《Journal of Neuroimmunology》。