小GTP酶RHO1通过与水通道蛋白TIP1;1的互作调控ROS稳态并差异性响应病原菌侵染（Nicotiana属植物）

《Molecular Plant Pathology》：The Small GTPase RHO1 Regulates ROS Homeostasis and Differentially Responds to Pathogens Infection via Interaction With Aquaporin TIP1;1 in Nicotiana

　　

小G蛋白（small G-protein）是植物生长与环境响应中的关键调控因子。然而，其调控植物对不同病原菌免疫反应的机制基础仍不明确。本研究发现，小GTP酶Ras同源蛋白1（RHO1）对不同类型的病原菌侵染表现出差异性响应。过表达RHO1增强了植物对辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV）和坏死型灰霉菌（Botrytis cinerea）侵染的敏感性，但增强了对活体营养型细菌丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性。进一步研究表明，RHO1与液泡膜内在蛋白1;1（TIP1;1）之间存在直接互作，TIP1;1是一种参与水分转运以及过氧化氢（H₂O₂）在液泡与细胞质之间运输的水通道蛋白。在病原菌侵染条件下，RHO1与TIP1;1的互作能够影响活性氧（ROS）在细胞质和液泡中的分布，促进ROS在细胞质中的积累，从而导致植物细胞对不同生活型病原菌产生不同的响应。此外，TIP1;1的表达水平在不同病原菌侵染下也发生改变。研究结果表明，小GTP酶RHO1通过调控ROS区隔化来影响植物对不同病原菌侵染的响应，揭示了植物基因对不同生物胁迫因子响应的多样性。

**论文解读：小GTP酶RHO1通过调控ROS区隔化介导烟草对不同病原菌的差异性免疫响应**

**一、研究背景与科学问题**

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是植物免疫反应中的关键信号分子，在病原菌识别、信号转导及防御基因激活等过程中发挥双重功能。一方面，ROS通过氧化病原菌细胞成分发挥直接的抗菌作用；另一方面，过量的ROS积累反而可能促进某些病原菌的侵染。已有研究表明，小G蛋白（small G-protein）与呼吸爆发氧化酶同源物（Respiratory Burst Oxidase Homologue，RBOH）家族互作，调控植物ROS的产生。在植物中，RAS家族缺失，RHO亚家族仅由Rac类ROP蛋白组成，ROP蛋白在侧根发育、花粉管极性生长、细胞周期调控及植物免疫受体复合物组装等多种细胞过程中具有重要功能。然而，ROP蛋白调控植物对不同生活型病原菌免疫反应的机制基础仍不清楚。水通道蛋白（aquaporin）尤其是液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic protein，TIP）家族，不仅调控水分运输，还介导过氧化氢（H₂O₂）等小分子的跨膜转运，在植物胁迫响应中发挥重要作用。本研究旨在揭示小GTP酶RHO1通过与液泡膜水通道蛋白TIP1;1的互作调控ROS稳态，进而介导植物对不同病原菌差异性免疫响应的分子机制。

**二、研究方法概述**

研究人员以本氏烟（Nicotiana benthamiana）和普通烟草（Nicotiana tabacum）为材料，采用以下关键技术开展研究：（1）利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）系统和农杆菌介导的稳定遗传转化构建RHO1沉默和过表达植株；（2）通过酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）筛选cDNA文库并以双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）验证蛋白互作；（3）运用反转录定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR）和Western blot检测基因表达和蛋白积累；（4）采用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）组织化学染色及2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H₂DCFDA）荧光探针检测ROS水平和亚细胞分布；（5）通过激光共聚焦显微镜结合液泡腔标记物VSD-mCherry观察ROS的胞内区隔化定位。病原菌接种包括辣椒脉斑驳病毒（chilli veinal mottle virus，ChiVMV）、丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000及其ΔhopQ1-1突变体）和灰霉菌（Botrytis cinerea）。

**三、主要研究结果**

**3.1 RHO1对不同病原菌侵染呈现差异性响应**

RT-qPCR结果显示，在本氏烟中，ChiVMV侵染12天（days post-inoculation，dpi）后RHO1转录水平显著上调；P. syringae ΔhopQ1-1侵染早期（3或9小时，hours post-inoculation，hpi）RHO1表达快速上调后逐渐下降；而B. cinerea侵染导致RHO1表达下调。在普通烟草中观察到一致的表达模式。VIGS沉默RHO1后，ChiVMV-GFP的侵染位点数和病毒外壳蛋白（coat protein，CP）积累显著降低，而Pst DC3000侵染造成的组织坏死更为严重且ROS积累水平降低，表明RHO1沉默抑制ChiVMV侵染但促进细菌性病害发生。

**3.2 RHO1过表达增强植物对ChiVMV和B. cinerea的敏感性**

研究人员构建了NbRHO1过表达的本氏烟转基因株系（RHO1ox#5和RHO1ox#14）及NtRHO1过表达的普通烟草株系（RHO1ox#18和RHO1ox#27）。接种ChiVMV-GFP后，过表达株系系统叶中GFP荧光强度显著增强，病毒CP的RNA和蛋白积累水平均显著高于野生型（wild-type，WT）植株。B. cinerea侵染后，过表达株系叶片上病斑直径显著大于WT。上述结果表明RHO1负调控植物对ChiVMV和B. cinerea的防御反应。

**3.3 RHO1正调控植物对P. syringae的抗性**

将Pst DC3000和ΔhopQ1-1接种RHO1过表达及WT植株后，平皿菌落计数结果显示，源自RHO1过表达株系的细菌菌落数显著少于WT植株，表明RHO1过表达增强了植物对P. syringae的抗性。综合上述结果，RHO1对不同生活型病原菌发挥相反的调控作用。

**3.4 NtRHO1与NtTIP1;1在体外和体内均存在直接互作**

以NtRHO1为诱饵进行Y2H文库筛选，获得液泡膜水通道蛋白NtTIP1;1为候选互作蛋白。BiFC实验证实NtRHO1与NtTIP1;1在体内互作，YFP荧光信号定位于液泡膜和细胞质。Co-IP实验进一步验证了二者的体内互作关系。序列比对和结构预测显示NtRHO1与NbRHO1具有97%的氨基酸一致性和高度相似的3D结构，表明二者功能保守。

**3.5 RHO1与TIP1;1的互作促进ROS积累**

将35S:NtTIP1;1单独或与35S:NtRHO1共转化本氏烟叶片后接种三种病原菌，DAB和NBT染色显示，共表达RHO1和TIP1;1的叶片在ChiVMV、ΔhopQ1-1和B. cinerea侵染下均表现出显著升高的ROS水平，而单独表达TIP1;1的叶片ROS水平无明显变化。H₂DCFDA荧光动力学分析进一步证实，共表达RHO1和TIP1;1的叶片ROS产生量在所有处理组中均显著升高，其中B. cinerea处理诱导的ROS水平最高。

**3.6 NtRHO1–NtTIP1;1互作削弱ROS的液泡转运**

利用VSD-mCherry标记液泡腔，结合H₂DCFDA荧光染色观察ROS的亚细胞分布。结果显示，在共表达RHO1和TIP1;1的叶片细胞中，H₂DCFDA绿色荧光信号主要分布于细胞质，与VSD-mCherry标记的液泡腔明显分离；而在单独表达TIP1;1或空载体的细胞中，ROS信号与液泡腔标记显著重叠。该结果表明RHO1–TIP1;1互作抑制了ROS向液泡的转运，导致ROS在细胞质中积累。

**3.7 不同病原菌侵染改变TIP1;1的表达水平**

RT-qPCR分析显示，本氏烟和普通烟草中TIP1;1的表达在ChiVMV侵染（12 dpi）和B. cinerea侵染（2 dpi）时均显著下调，而在ΔhopQ1-1侵染（4 hpi）时显著上调。TIP1;1在不同病原菌侵染下的差异性表达进一步支持其参与病原菌特异性ROS调控。

**四、讨论与结论**

已有研究表明小GTP酶在植物生物胁迫防御中发挥关键作用，不同ROP蛋白既可作为抗病正调控因子，也可作为感病负调控因子。本研究发现RHO1对不同生活型病原菌呈现截然相反的调控功能，体现了植物内源基因对不同生物胁迫因子响应的多样性。ROS在植物免疫中具有双重且依赖情境的功能：强ROS爆发可有效限制活体营养型病原菌，但可能促进坏死营养型病原菌和病毒的侵染。水通道蛋白作为ROS运输和分布的关键介质，在维持ROS稳态中发挥重要作用。本研究发现RHO1与液泡膜水通道蛋白TIP1;1的互作削弱了ROS向液泡的区隔化转运，导致细胞质ROS积累，从而根据病原菌生活型产生不同的免疫结果。该研究揭示了小GTP酶RHO1通过调控ROS区隔化影响植物对不同病原菌免疫响应的新机制，为空间氧化还原调控策略用于培育兼具广谱抗病性和生长平衡的作物品种提供了理论依据。

研究结论：RHO1通过与液泡膜水通道蛋白TIP1;1互作，调控ROS在细胞质与液泡之间的区隔化分布——该互作促进细胞质ROS积累，从而增强植物对活体营养型细菌P. syringae的抗性，但有利于坏死营养型真菌B. cinerea和ChiVMV的侵染。该发现阐明了小GTP酶RHO1调控ROS代谢进而影响植物对不同病原菌差异性响应的机制，揭示了植物基因对不同生物胁迫因子响应的多样性，并提示空间氧化还原调控可作为工程化平衡且广谱抗病性的潜在策略。