大豆全生育期抗白粉病基因GmRmd1介导调控白粉病抗性的转录与功能解析

《Molecular Plant Pathology》：Transcriptional and Functional Insights Into the All-Stage Resistance Gene GmRmd1-Mediated Regulation of Resistance to Powdery Mildew in Soybean

　　

由Microsphaera diffusa引起的白粉病（PMD）是大豆一种毁灭性叶部病害。研究人员在广西地方品种MSRF（全生育期抗PMD）中鉴定出GmRmd1为候选基因，并验证其为正向调控PMD抗性的调节因子。超敏反应（HR）检测确认其Toll白细胞介素-1受体（TIR）、核苷酸结合位点（NBS）及碱性分泌蛋白（BSP）结构域对免疫反应至关重要。GmRmd1受M. diffusa诱导表达，其表达被GmWRKY27和GmERF138分别通过特异性结合GmRmd1启动子区的W-box与GCC-box元件所抑制。RNA-Seq揭示16号染色体（chr16）抗性簇基因（Glyma.16G214100、Glyma.16G214200、Glyma.16G215100和Glyma.16G215800）呈现GmRmd1相关表达模式。酵母双杂交、双分子荧光互补及荧光素酶实验表明GmRmd1不仅自身互作，还与GmRmd2（Glyma.16G215100）、GmRmd3（Glyma.16G214900）及GmRnl1（NLR辅助因子）互作。此外，GmRmd3与GmRnl1突变体对M. diffusa更感病。值得注意的是，GmRmd1通过与木质素合成相关蛋白GmPER1互作并增加木质素合成从而增强PMD抗性。基因组分析显示携带GmRmd1位点的中国大豆种质数量呈北多南少、西多东少分布。综上，GmRmd1与GmRmd2、GmRmd3、GmRnl1形成功能性蛋白复合体，调控木质素生物合成进而调制病害抗性，为GmRmd1介导大豆PMD抗性的分子机制提供了新视角。

研究背景方面，大豆（Glycine max）作为食用油与植物蛋白核心作物，由Microsphaera diffusa引起的白粉病（PMD）在冷凉高湿环境下可造成高达40%产量损失。尽管自1993年起所有已定位PMD抗性基因均位于chr16远端Rmd位点，且Xian等已于2022年鉴定出全生育期抗性（ASR）材料B13中的GmRmd1，但GmRmd1是否在其他抗源中承担同样功能、其下游机制仍不清楚。本研究以广西地方品种MSRF（ASR）与高感品种Huaxia 3（HX3）为亲本，系统解析GmRmd1的抗性贡献与分子通路，论文发表于《Molecular Plant Pathology》。

主要关键技术方法包括：基于MSRF×HX3衍生的MH群体（F₂至F₆共2284株F₂及194个F_2:3家系）进行抗病遗传分离与SSR/InDel标记初定位至细定位，将Rmd_MSRF界定于chr16上9590 bp区间仅含Glyma.16g214300（即GmRmd1）；利用CRISPR/Cas9在Williams 82（W82）背景构建rmd1-ko1/ko2敲除体及EMS突变体进行功能丧失验证；对MSRF与HX3接种后0/24/72 hpi取样开展RNA-Seq（Illumina NovaSeq 6000，比对Wm82.a4.v1）筛选差异表达基因（DEGs）并富集苯丙烷通路；采用酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、双荧光素酶报告实验验证GmWRKY27/GmERF138对启动子W-box/GCC-box的抑制；通过酵母双杂交（Y2H）、膜系统Y2H、双分子荧光互补（BiFC）、_split-luciferase及本氏烟（Nicotiana benthamiana）HR Assay界定GmRmd1结构域功能与蛋白互作网络；乙酰溴法测定接种7 dpi叶片木质素含量；基于315份国内种质及2898份全球重测序数据评估GmRmd1编码区完整性地理分布。

研究结果部分，2.1节细定位证明MSRF抗性由单显性基因Rmd_MSRF控制，最终落于InDel418292–InDel427936间9590 bp区间唯一基因GmRmd1，其LRR被BSP替换形成TIR-NBS-BSP新型TNX家族结构。2.2节CRISPR敲除显示rmd1-ko1（外显子1第139 bp G-A致提前终止）与rmd1-ko2（靶位点2第554 bp T-C致构象改变）均感病，菌丝附着量显著高于W82，确认GmRmd1正向调控抗性且亚细胞定位于核与质膜。2.3节RNA-Seq表明GmRmd1在MSRF于24 hpi达峰，苯丙烷通路16个DEG中8个（含GmPER1/Glyma.11G162100）与GmRmd1共表达，chr16簇内Glyma.16G214100/214200/215800同向变化。2.4节Y1H/EMSA/双LUC证实GmWRKY27结合W-box（5′-TTGACT-3′，?101 bp）、GmERF138结合GCC-box（5′-GCCGCC-3′，?2422 bp）并抑制启动子活性（LUC降至对照4.0–16.4倍抑制）。2.5节本氏烟HR Assay显示全长GmRmd1及GmRmd1^1-214等诱导枯斑，而单域或E46Stop/L184P等丧失活性，证明TIR-NBS-BSP三者完备性及1–214位为最小功能单元。2.6节Y2H/BiFC/split-LUC证GmRmd1自身核内互作，各域均可寡聚。2.7节筛得chr16簇内GmRmd2（TIR-NBS）、GmRmd3（TIR-NBS-LRR）及17号染色体GmRnl1（RPW8-NBS，NRG1类辅助NLR）与GmRmd1互作；rmd3-1与w82-rnl1 EMS突变体感病；膜Y2H仅GmPER1与GmRmd1互作，敲除体木质素显著低于W82。2.8与2.9节显示315份国内种质中完整GmRmd1编码区211份里96.2%抗病，缺失104份里97.2%感病；全球2898份中完整等位组1/4集中于欧洲与东北中国，中国境内完整位点比例从山西94.6%、河北87.6%降至广东57.1%、江西36.4%，呈北南递减、西东递减。

讨论部分总结：GmRmd1属非典型TNL，以BSP替LRR暗示依赖协同蛋白识菌；其自身寡聚及与GmRmd2/3同源簇NLR、GmRnl1（helper NLR）形成sensor-helper复合体，类比拟南芥EDS1-SAG101-NRG1轴；GmWRKY27/GmERF138负向转录门控解除后诱导表达；下游经GmPER1促木质素沉积构筑物理屏障。该模块（GmERF138/GmWRKY27–GmRmd1–GmRmd2/GmRmd3/GmRnl1–GmPER1–木质素）首次在豆科PMD中贯通“转录抑制—NLR寡聚—辅助NLR放大—苯丙烷加固”链条。

结论翻译：研究人员提出，无M. diffusa侵染时GmWRKY27与GmERF138分别结合GmRmd1启动子W-box与GCC-box抑制其表达；侵染后抑制解除，GmRmd1与GmRmd2经自互作形成同源二聚，并与GmRmd3、GmRnl1组装复合体，调控木质素合成基因（含GmPER1）表达以促进木质化，从而增强对M. diffusa抗性。该研究在GmERF138/GmWRKY27–GmRmd1–GmRmd2/GmRmd3/GmRnl1模块层面阐明大豆PMD抗性调控机理，为基于完整GmRmd1位点的分子设计育种提供理论支撑与种质资源依据。