《Plant Physiology and Biochemistry》：Beyond oxidative stress: Tetrakis (4-hydroxyphenyl) porphyrin induces non-canonical programmed cell death in Tobacco BY-2 cells
编辑推荐：
摘要：光敏剂是天然存在或人工合成的吸光色素，广泛分布于生物界，并在光合作用（如叶绿素）等生物过程中发挥核心作用。光敏剂的暗毒性在很大程度上仍未得到充分研究，尤其是在植物中。本研究聚焦于中性卟啉四(4-羟基苯基)卟啉（THPP），并在烟草Bright Yello
摘要：光敏剂是天然存在或人工合成的吸光色素，广泛分布于生物界，并在光合作用（如叶绿素）等生物过程中发挥核心作用。光敏剂的暗毒性在很大程度上仍未得到充分研究，尤其是在植物中。本研究聚焦于中性卟啉四(4-羟基苯基)卟啉（THPP），并在烟草Bright Yellow-2（TBY-2）细胞中进行测试。浓度为10 μM的THPP在黑暗中诱导了显著的植物细胞死亡，表明其具有毒性。为理解THPP诱导的毒性及细胞死亡的机制，研究人员检测了THPP在TBY-2培养基中的自组装行为及其细胞定位。3小时后，THPP在TBY-2废弃培养基中表现出显著的稳定性，这在一定程度上解释了其暗毒性。在4 °C下与THPP共孵育限制了其细胞渗透，表明其被细胞主动内化。暴露于THPP导致细胞活力显著降低，伴随线粒体代谢活性下降和线粒体膜电位耗散。共聚焦成像显示THPP主要定位于细胞核周围，并在细胞质中呈弥散分布且与线粒体共定位。尽管THPP具有显著的细胞毒性，但它并未诱导典型程序性细胞死亡（PCD）相关的标志性特征。重要的是，用渥曼青霉素抑制自噬可显著降低THPP诱导的细胞死亡，表明自噬参与了THPP诱导的细胞死亡反应。
论文解读
一、研究背景与科学问题
光动力处理基于光敏剂（photosensitizers, PS）与光的结合，已在癌症治疗、病原微生物控制和食品水净化等领域得到广泛应用。近年来，光动力策略在农业领域也受到越来越多的关注，主要用于防控植物病原菌及其他农业相关生物。光敏剂在紫外-可见光照射下被光活化，产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），从而对细胞组分造成氧化损伤并最终影响靶标生物的生存能力。
然而，光敏剂在无光条件下的暗毒性长期被忽视。在动物中，卟啉在黑暗中的积累已被充分记录和研究，如卟啉症是由血红素生物合成途径缺陷引起的一组罕见代谢疾病，即使没有光照，特定卟啉的积累也可导致细胞毒性。卟啉能够进行氧化还原循环，接受和提供电子给包括NADPH氧化酶和含铁酶等氧化还原活性物种，从而在富铁环境中（如肝脏或红细胞）产生活性氧。此外，卟啉在线粒体中的积累可通过改变线粒体膜电位并诱导癌细胞凋亡来破坏线粒体功能。
在微生物中，某些卟啉在无光条件下也表现出毒性，如血卟啉二甲醚可抑制燕麦镰孢的分生孢子萌发，阳离子卟啉TMPyP对铜绿假单胞菌具有暗毒性，铁卟啉则通过Fenton反应释放氧化还原敏感铁产生羟基自由基而对大肠杆菌具有暗毒性。
在农业领域，多种活性物质的作用方式依赖于光敏剂在细胞内的过度积累及其在阳光照射后的活化。原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase, PPO）抑制剂（如butafenacil和trifludimoxazin）及5-氨基乙酰丙酸便是典型例子，其作用机制依赖于PPO酶抑制或底物过饱和，导致下游卟啉积累。但这些研究的焦点主要在于光动力胁迫，而非光敏剂本身的细胞毒性积累效应，植物中缺乏光照条件下光敏剂细胞毒性的系统研究。在植物细胞中，有研究显示阳离子卟啉在100 μM浓度下可通过与DNA相互作用对洋葱根尖分生组织细胞产生遗传毒性，但中性卟啉在植物细胞暗条件下的效应此前尚无报道。因此，本研究旨在探究中性卟啉四(4-羟基苯基)卟啉在暗条件下对植物细胞的作用及其机制。
二、研究方法概述
本研究以烟草Bright Yellow-2（TBY-2）悬浮细胞为材料（细胞系为4日龄指数生长期悬浮培养物），采用紫外-可见吸收光谱分析THPP在不同培养基中的聚集行为；利用共聚焦激光扫描显微镜结合细胞器特异性荧光探针（MitoTracker、Rhodamine 123、DAPI、Calcofluor White）检测THPP的亚细胞定位；通过台盼蓝染色法评估细胞死亡率；MTT还原实验检测细胞代谢活性；丙二醛含量测定、总巯基含量测定及抗氧化酶活性检测评估氧化应激状态；RT-qPCR分析自噬相关基因（ATG1a、ATG2、ATG3、ATG8a）及液泡加工酶基因（VPE1a、VPE1b）的表达；DNA片段化分析、metacaspase活性测定和VPE活性测定用于表征细胞死亡模式；渥曼青霉素（wortmannin）药理学抑制实验验证自噬在细胞死亡中的功能贡献。
三、主要研究结果
（一）THPP在TBY-2废弃培养基中发生二聚化
紫外-可见光谱分析显示，THPP在乙醇中呈现典型的单一尖锐Soret带和四个Q带。当在TBY-2废弃培养基（pH 4.5）中测试时，10 μM THPP表现出宽化的红移Soret带（宽度约150 nm，峰位423 nm）和异常Q带形态，提示THPP以单体、J型二聚体和H型二聚体三种形式共存。在1小时的孵育中，水中的THPP Soret带峰值下降约88.3%，新鲜培养基中下降约55.4%，而废弃培养基中即使3小时后仅下降约20%，表明TBY-2细胞分泌的某些分子（可能包括分泌型糖醛酸）能够通过氢键或其他非共价相互作用稳定THPP。
（二）THPP在黑暗中诱导TBY-2细胞死亡
将TBY-2细胞与1至10 μM浓度范围的THPP在黑暗中孵育，结果显示1和2 μM处理未产生明显毒性，而5和10 μM处理分别诱导约20%和35%的细胞死亡，呈浓度依赖性。值得注意的是，在如此低的浓度下，其他带电荷的、游离碱或金属化卟啉在TBY-2细胞中均未表现出暗毒性。
（三）THPP通过主动内化进入细胞并主要定位于核周和线粒体
共聚焦显微镜检测发现，THPP分布于细胞核周围和细胞质中，但不进入液泡。当细胞在4 °C下与THPP共孵育时，THPP大量滞留于质膜/质外体/细胞壁区域，表明其内化依赖主动运输过程（如内吞作用）而非被动扩散。进一步的亚细胞定位分析显示，THPP与线粒体荧光信号存在显著共定位，同时还呈现弥散的细胞质和核周分布模式。
（四）THPP不诱导氧化应激
丙二醛含量测定显示THPP处理后无显著升高。抗氧化酶活性检测表明，过氧化氢酶（catalase, CAT）、愈创木酚过氧化物酶（guaiacol peroxidase, GPOX）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）的活性均未因THPP处理而增强。总巯基含量也未出现显著变化。DCFDA荧光探针检测显示，THPP处理后细胞内ROS没有积累，在THPP检测到的区域也未见局部ROS产生。这些结果表明THPP的暗毒性并非通过氧化还原循环产生活性氧来介导。
（五）THPP通过影响线粒体功能改变细胞代谢活性
MTT还原实验显示，THPP处理后formazan产量显著降低，且10 μM处理组较5 μM处理组的抑制作用更强，呈现浓度依赖性效应。Rhodamine 123染色结果表明，THPP处理导致线粒体膜电位（ΔΨm）丧失，荧光强度显著下降。综合线粒体共定位结果、代谢活性降低和膜电位丧失，表明线粒体是THPP发挥细胞毒性的主要靶标。
（六）THPP诱导的细胞死亡为非典型细胞死亡
10和25 μM THPP处理均未引起细胞皱缩等凋亡样形态学变化。DNA片段化分析显示，THPP处理未产生DNA梯状条带（凋亡样细胞死亡标志）或弥散DNA涂片（坏死标志）。Metacaspase活性测定显示THPP处理导致metacaspase活性显著增加约2倍，进一步排除了坏死途径。VPE1a基因表达在THPP处理后显著上调约3.0倍，但VPE1b表达无显著差异，且总VPE酶活性未发生显著变化，表明THPP诱导的细胞死亡不依赖VPE介导的液泡性细胞死亡途径。上述特征综合表明，THPP诱导了一种缺乏已建立植物PCD典型特征的调控性细胞死亡途径，即非典型程序性细胞死亡。
（七）自噬参与THPP介导的细胞死亡
RT-qPCR分析显示，THPP处理后自噬相关基因ATG1a、ATG2、ATG3和ATG8a的表达分别上调4.04倍、6.9倍、12.7倍和7.4倍，其中ATG3的诱导程度最高。渥曼青霉素（一种自噬抑制剂）与THPP共处理可显著将细胞死亡率从约35%降至约19%，而渥曼青霉素单独处理对细胞死亡无显著影响。这一药理学证据表明自噬确实参与了THPP诱导的细胞死亡执行过程，而非仅仅是胁迫的副作用。
四、讨论与结论
本研究表明，THPP在TBY-2废弃培养基中主要以单体、H型和J型二聚体形式存在，并被细胞通过主动内化方式摄取。THPP的核周分布模式和线粒体定位于共聚焦显微镜下清晰可见。尽管THPP具有显著细胞毒性，但未诱导氧化应激，这提示线粒体功能障碍与氧化应激在该体系中发生了解偶联，即线粒体损伤可能是通过代谢抑制或线粒体功能直接受损等非氧化性机制发生的。THPP诱导的细胞死亡缺乏DNA片段化和细胞皱缩，虽然metacaspase活性增加，但未呈现典型的凋亡样形态。自噬相关基因的上调及渥曼青霉素的部分保护效应进一步证实自噬在细胞死亡执行中的功能贡献。
研究提出的模型为：THPP在核周区域积累并与线粒体结合，导致线粒体功能障碍，这一事件与metacaspase激活和自噬相关途径诱导相关联，最终引发涉及自噬的细胞死亡。该过程独立于ROS积累、脂质过氧化、VPE激活、DNA片段化和细胞皱缩。因此，该研究提出了一种以线粒体功能障碍和自噬性执行机制为核心的非典型程序性细胞死亡途径。
结论部分指出，THPP在无光条件下对TBY-2细胞表现出显著的毒性，这在其已确立的光毒活性之外揭示了一种不依赖光的效应。从农学角度看，THPP这类基于卟啉的化合物在用于农业抗菌光动力应用时，其在低光或暗条件下可能仍保持生物活性，这种不依赖光的生物活性应在评估非靶标效应和环境安全性时加以考虑，尤其是在土壤等光穿透受限的环境中，暗毒性可能独立于光动力ROS产生而对非靶标土壤微生物产生影响。值得注意的是，TBY-2细胞在黑暗中生长的能力为研究植物中难以与光动力效应分离的卟啉暗毒性提供了一个有用的实验系统。此外，THPP及其衍生物在MCF-7细胞中相似的胞内积累模式提示，卟啉在植物和动物细胞中的某些细胞内化机制可能是保守的，但THPP诱导细胞死亡的具体机制仍需深入研究。
