OXR2整合UV-B光形态建成信号、DNA修复、细胞周期调控及酚类化合物积累于拟南芥中

《Plant Physiology and Biochemistry》：OXR2 integrates UV-B photomorphogenic signalling, DNA repair, cell cycle regulation, and phenolic compound accumulation in Arabidopsis thaliana.

　　

摘要

紫外线B（UV-B）辐射对植物具有双重效应，既作为发育信号，又作为遗传胁迫的来源。植物必须在生长、DNA修复、细胞分裂和损伤缓解之间取得平衡。氧化抗性（OXR）蛋白是一类进化上保守的、含有TLDc结构域的线粒体蛋白，可将氧化还原稳态与核胁迫响应联系起来，这使其成为协调植物UV-B响应的有力候选因子。本研究表明，拟南芥蛋白AtOXR2及其向日葵直系同源蛋白HaOXR2对于增强植物对UV-B辐射的耐受性至关重要。过表达AtOXR2或HaOXR2的转基因植物在UV-B辐射下表现出改善的生长状态，叶片、下胚轴和根发育的抑制程度减轻。此外，这些植物表现出减少的分生组织细胞死亡和更少的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）——一种主要的UV-B诱导DNA损伤形式。使用PlaCCI报告基因进行的体内分析显示，野生型植物在UV-B处理后阻滞于G2/M期，而过表达OXR2的株系维持富集G1/S期的细胞周期分布，表明对UV-B损伤的感知减弱。此外，这些植物表现出与光信号、DNA修复和细胞周期检查点相关基因的表达升高，同时保护性酚类和黄酮类化合物的积累增加。功能缺失型oxr2突变体未表现出降低的UV-B敏感性，这可能是由于其他OXR家族成员介导的补偿性机制上调所致。比较转录组分析支持一个双模块模型，即OXR2预激活经典的UV-B损伤响应，从而确立OXR2作为UV-B耐受性的农艺决定因子。

**OXR2整合UV-B光形态建成信号、DNA修复、细胞周期调控与酚类化合物积累：拟南芥UV-B耐受性的多层级调控机制**

**1. 研究背景与科学问题**

植物作为固着生物，持续暴露于全光谱太阳辐射下。紫外线B（UV-B，280–315 nm）是太阳光谱中的高能组分，虽仅占总辐照度的一小部分，却具有显著的双重生物学效应。低通量UV-B作为信息信号，诱导光形态建成适应，包括UV吸收类黄酮的生物合成、下胚轴缩短以及昼夜节律和胁迫响应转录组的调节；而高通量UV-B则作为强非生物胁迫因子，损伤生物大分子、诱导活性氧（ROS）产生并造成基因毒性DNA损伤。因此，植物需要在UV-B感知与损伤缓解之间取得平衡，而这一平衡的分子基础目前尚不清楚。

光形态建成响应由UVR8光受体启动，UVR8在吸收UV-B后单体化并转位至细胞核，与COP1互作，稳定bZIP转录因子HY5，进而驱动包括查尔酮合酶（CHS）、二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）等苯丙烷代谢酶在内的一百余个UV-B响应基因的转录。该通路受RUP1/RUP2负反馈调节。在高通量UV-B下，DNA光化学吸收产生环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）和嘧啶(6-4)嘧啶酮光产物（6-4 PPs），植物通过光复活（由光裂解酶UVR2和UVR3介导）和核苷酸切除修复（NER）两条途径修复损伤。DNA损伤响应（DDR）由顶端PI3K样激酶ATM和ATR磷酸化SOG1转录因子调控，诱导细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂SMR家族等靶基因表达。E2F转录因子在UV-B响应中发挥非冗余功能。

氧化抗性（OXR）蛋白家族在酵母、植物和脊椎动物中进化保守，含有C末端TLDc结构域。哺乳动物OXR1在氧化胁迫下对神经元存活至关重要。拟南芥中有6个OXR家族成员，其中AtOXR2是定位于线粒体的蛋白，受氧化胁迫诱导，过表达可提高生物量、光合性能和种子产量。然而，AtOXR2在UV-B响应中的作用此前尚未被研究。鉴于UV-B暴露将基因毒性、光形态建成信号和ROS产生整合为单一刺激，研究人员提出假设：AtOXR2作为线粒体节点，连接氧化还原稳态与核UV-B响应，包括UVR8介导的光形态建成信号、DNA修复、细胞周期调控和程序性细胞死亡（PCD）。

**2. 主要技术方法**

本研究采用多种技术手段：使用拟南芥T-DNA插入突变体（oxr2.1和oxr2.2）、两个独立的AtOXR2过表达株系以及三个表达向日葵HaOXR2的转基因株系；通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合碘化丙啶（PI）染色定量根尖分生组织细胞死亡；利用PlaCCI细胞周期报告系统进行体内细胞周期进程的时空监测；采用免疫斑点印迹检测CPD积累；运用RT-qPCR分析基因表达；通过Folin–Ciocalteu法和氯化铝比色法分别测定总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）；并将过表达植株的基础转录组与四个公开的拟南芥UV-B转录组数据集进行超几何检验交叉比较。

**3. 研究结果**

**3.1 OXR2过表达缓解UV-B对莲座生长的抑制并减弱细胞壁松弛基因的抑制**

UV-B辐射显著诱导AtOXR2、AtOXR3和AtOXR5的表达，而AtOXR4表达不变。在连续3天、每天2小时4 W·m?2的UV-B脉冲处理后，野生型（WT）和oxr2突变体莲座面积显著减少，而AtOXR2和AtHaOXR2过表达株系保持显著较大的莲座面积。细胞壁松弛基因EXP1和EXP3在UV-B下受抑制的程度在过表达株系中显著减弱。

**3.2 OXR2过表达减少UV-B对下胚轴生长和主根伸长的抑制**

UV-B暴露使WT植株下胚轴长度减少约20%，而过表达株系维持约90%的下胚轴长度。UV-B使WT根伸长减少约65%，而过表达株系维持80–85%的伸长率。这一耐受表型在全部五个独立过表达株系中一致观察到。

**3.3 OXR2过表达减少UV-B诱导的分生组织细胞死亡和DNA损伤**

UV-B处理后24小时，WT根尖分生组织每个分生组织约有9个PI阳性死亡细胞，而过表达株系的死亡细胞数仅为WT的50–60%。CPD免疫检测显示WT在UV-B后表现出最高的CPD积累，过表达株系显著降低CPD水平。oxr2突变体与各自WT无差异，RT-qPCR检测发现oxr2突变体中AtOXR3和AtOXR5显著上调，表明存在旁系同源基因的转录补偿。

**3.4 OXR2过表达差异调控DNA修复和损伤检查点基因的表达**

UV-B后，UVR2在所有过表达株系中过度诱导；UVR3在基础条件下已升高；UVR7在UV-B后诱导增强。相反，UVR6在WT中UV-B诱导显著，但在过表达株系中诱导较低。ATM和ATR在过表达株系的对照条件下已显著升高，UV-B后维持更高水平，呈现“预激活”表达模式。

**3.5 OXR2过表达调控E2F转录因子表达并改变UV-B诱导的细胞周期阻滞方向**

UV-B后WT中E2FA和E2FC强诱导，而过表达株系诱导减弱。E2FD在过表达株系的基础条件下组成型上调，UV-B后进一步诱导。PlaCCI报告系统体内成像显示，UV-B后WT根在晚G2/M期积累细胞，而过表达株系的细胞周期分布与未辐照条件基本一致，表明OXR2过表达阻止了UV-B诱导的细胞周期检查点激活。

**3.6 OXR2过表达放大UVR8–COP1–HY5光形态建成信号**

UVR8转录水平在各基因型和处理间无差异。UV-B后COP1在过表达株系中诱导增加，而WT中无诱导。HY5在WT和过表达株系中均被诱导，但过表达株系中增强。负反馈调节因子RUP1和RUP2在过表达株系中表现出更显著的UV-B诱导，表明OXR2过表达更强烈地激活整个UVR8转录输出。

**3.7 OXR2过表达促进酚类化合物积累和黄酮途径转录**

CHS在UV-B后各基因型均被诱导。DFR在UV-B后在过表达株系中上调程度显著高于WT，表明OXR2优先激活黄酮途径的晚分支。TPC和TFC在过表达株系中显著高于WT。oxr2突变体的TPC和TFC与各自WT无显著差异。

**3.8 AtOXR2介导UV-B耐受表型的双模块分子模型**

将oeOXR2植株的基础转录组与四个公开数据集比较发现：与310 nm UV-B处理45分钟的早期响应基因显著重叠（25个基因，3.14倍，P = 5×10??），包含RUP1、BHLH150、HFR1及GRXS3/GRXS5等；与280 nm UV-B处理2天的慢性损伤响应呈显著拮抗（123个基因，3.24倍，P = 10?33）；与Brown等（2005）的72个UVR8/HY5调控基因中7个呈基础下调（6.31倍，P = 1.2×10??）；与Tavridou等（2020）的6小时UV-B转录组比较发现41个基础上调/UV-B下调基因和62个基础下调/UV-B上调基因；与med17突变体转录组交叉比较发现42个基因在oeOXR2中上调而在med17中下调（3.16倍，P = 4.7×10?11），其中包含HFR1、BBX22、BT1/2/3、LTI78/RD29A、LEA7、GRXS3/4等，构成一个生物学上连贯的“胁迫预激活”模块。

**4. 讨论与结论**

**4.1 讨论要点**

OXR2过表达选择性增强光裂解酶和DDR相关基因表达：UVR2和UVR3的增强诱导与CPD积累减少一致；UVH6的较低诱导可能反映光复活能力增强后NER需求降低；ATM/ATR的组成型升高构成预激活的DDR状态。

OXR2将UV-B诱导的细胞周期阻滞从G2/M重定向至G1，与E2F转录因子协调：E2FA诱导减弱与PCD减少直接相关；E2FC不诱导解除转录抑制；E2FD/DEL2的组成型上调与UVR2表达升高机制性一致。

OXR2放大UVR8–COP1–HY5光形态建成模块：在UVR8转录不变的情况下，COP1、HY5、RUP1/RUP2的诱导均增强。HY5与负反馈调节因子同时放大表明“预激活但受约束”的信号状态。

OXR2增强苯丙烷途径输出和UV屏蔽能力：DFR的选择性上调使通量转向花青素，与TPC和TFC增加一致。升高的黄酮作为分子防晒屏降低到达DNA的光子通量，与增强的光复活共同解释CPD水平降低。

HaOXR2在每个检测参数上都与AtOXR2产生基本一致的表型，证实了TLDc结构域的深度进化保守性，向日葵作为喜光植物，其HaOXR2可能具有适用于作物育种的优良特性。

**4.2 研究结论**

本研究鉴定线粒体OXR家族成员AtOXR2为拟南芥中多个UV-B响应通路的此前未被表征的整合因子。两种物种的过表达实验证明，OXR2同时：（i）放大UVR8–COP1–HY5光形态建成转录输出；（ii）选择性增强光裂解酶和检查点相关基因（UVR2、UVR3、UVR7、ATM、ATR）的诱导；（iii）与非典型E2FD/DEL2转录因子协调，将UV-B诱导的细胞周期阻滞从经典G2/M模式重定向至G1/S检查点模式；（iv）增强苯丙烷生物合成（尤其是DFR）以及总酚和总黄酮的积累。仅AtOXR2缺失无可检测的UV-B表型，原因是AtOXR3和AtOXR5的补偿性转录上调。基础oeOXR2转录组与公开UV-B和Mediator相关数据集的交叉比较揭示，这些表型产生于一致的双模块分子结构：上游预激活保护模块与下游对经典UVR8/HY5损伤转录组的预占。HaOXR2的功能等效性确立了这一整合角色的深度进化保守性，并将OXR2确定为工程改良作物UV-B耐受性的候选基因，特别是在平流层臭氧扰动和气候变化导致UV-B通量增加的背景下具有重要应用价值。