大豆GmIAA9异源表达增强烟草低磷胁迫耐受性

《Plant Stress》：Heterologous Expression of Soybean GmIAA9 Enhances the Tolerance of Tobacco to Low Phosphorus Stress

　　

摘要

大豆（Glycine max [L.] Merr.）对磷缺乏高度敏感，然而AuxIAA基因在磷效率中的作用尚不清楚。本研究从大豆磷高效近等基因系中克隆了GmIAA9，并通过在烟草中的异源过表达研究了其功能。在低磷胁迫（LP）下，过表达GmIAA9的烟草表现出显著改善的根系构型，总根长和根表面积分别增加25.4%和19.4%，同时总生物量增加54.9%。生理分析表明，GmIAA9过表达使酸性磷酸酶和过氧化物酶活性分别提高高达51.6%和136%，同时使丙二醛含量降低77.0%，表明其增强了磷 mobilization并缓解了氧化损伤。激素测定显示，在低磷条件下，GmIAA9促进根中生长素（IAA）和脱落酸（ABA）的积累，分别增加245%和59.4%。qRT-PCR证实GmIAA9在1小时内被快速诱导且具有根组织偏好性，在7小时达到峰值。转录组分析表明差异表达基因涉及苯丙烷生物合成、细胞周期和核质转运途径。综上所述，异源烟草系统中的研究结果表明，GmIAA9通过协调调控根系发育、磷活化、抗氧化防御和激素信号传导来增强低磷耐受性，为大豆磷高效育种提供了候选基因。

**大豆GmIAA9基因异源表达增强烟草低磷胁迫耐受性的研究解读**

**1. 研究背景与科学问题**

磷（Phosphorus, P）是植物生长发育所必需的大量营养元素，参与能量代谢、核酸合成、膜系统构建及信号转导等关键生物学过程。然而，土壤中的磷易与铁、铝、钙等金属离子形成难溶性化合物，导致其生物有效性显著降低，尤其在酸性土壤中此现象尤为突出。磷缺乏已成为限制作物产量与品质的重要因子。近年来，土壤有效磷不足与肥料利用效率低下的问题日益严峻，而过量施肥又引发水体富营养化等环境问题，因此提高作物磷效率已成为可持续农业发展的关键方向。

植物在长期进化过程中形成了多层次的低磷胁迫适应机制：在形态层面，通过调控主根伸长、促进侧根形成和根毛发育来重塑根系构型，扩大磷吸收表面积；在生理层面，通过分泌有机酸、酸性磷酸酶和质子来活化土壤中难溶性磷；在分子层面，磷信号通路关键因子PHR家族与植物激素网络之间的交叉对话发挥核心调控作用。值得注意的是，生长素信号通路中的Aux/IAA基因家族在根系发育和逆境响应中具有重要功能。该家族基因编码短命核蛋白，作为生长素信号转导中的转录抑制子发挥作用，通过26S蛋白酶体依赖的蛋白降解实现快速信号调控。

近年研究表明，多个Aux/IAA家族成员参与植物对营养胁迫的响应。例如，拟南芥AtIAA14通过与ARF7/19相互作用调控侧根形成，增强对低磷的适应；水稻OsIAA13介导生长素信号调节根和地上部发育，提高磷吸收效率。然而，Aux/IAA基因在大豆磷效率调控中的具体功能及其与其他通路的相互作用尚不清楚。本研究前期利用磷高效大豆近等基因系（Near-isogenic lines, NILs），通过SSR和转录组筛选鉴定出GmIAA9为受低磷胁迫显著诱导的基因。作为Aux/IAA家族成员，GmIAA9表现出明显的根组织特异性表达。本研究旨在通过分析其序列特征和系统发育关系、评估其在烟草中异源过表达在低磷条件下的表型、生理及激素效应，并通过比较转录组分析鉴定下游转录通路，系统阐明GmIAA9在低磷胁迫响应中的功能。

**2. 主要技术方法**

研究人员从大豆磷高效近等基因系根系中提取总RNA并逆转录获得cDNA，基于NCBI参考基因组设计特异性引物克隆GmIAA9的编码序列（Coding Sequence, CDS）。利用ExPASy ProtParam工具预测蛋白理化性质，DNAMAN软件进行同源序列比对，MEGA 7软件以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树（1000次自举检验）。通过构建35S:GmIAA9-GFP融合表达载体，经农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105介导转化野生型烟草（Nicotiana tabacum L.），获得纯合T?转基因株系；采用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位。实验设置低磷（Low phosphorus, LP, 20 μmol/L KH?PO?）和高磷（High phosphorus, HP, 1250 μmol/L KH?PO?）两种处理，利用Epson 13000xl根系图像分析系统获取根系构型参数；采用特定试剂盒测定丙二醛（MDA）、酸性磷酸酶（ACP）、过氧化物酶（POD）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性和叶绿素含量，Triphenyl tetrazolium chloride（TTC）还原法测定根系活力，凯氏定氮法和钼锑抗比色法测定氮磷含量；采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UHPLC-QTRAP-MS/MS）结合稳定同位素标记内标定量内源激素；qRT-PCR检测基因表达动态；转录组测序基于DNBSEQ-T7平台完成，差异表达基因（Differentially expressed genes, DEGs）筛选标准为FDR<0.05且|log? fold change|≥1。

**3. 研究结果**

**3.1 GmIAA9序列特征分析**

大豆Aux/IAA9基因的开放阅读框（Open reading frame, ORF）长度为588 bp，编码195个氨基酸，该序列已提交至GenBank（登录号PZ171990）。蛋白特性预测表明GmIAA9编码蛋白分子量约为21.5 kD，理论等电点为6.84，不稳定指数为71.49，属于不稳定蛋白；脂肪指数为65.80，平均亲水性（GRAVY）为-0.545，表明其为亲水性蛋白。系统发育分析显示，GmIAA9与苹果MdIAA14-like、番茄SlIAA17和杨树Pt22B-like等双子叶植物Aux/IAA蛋白聚为一支，自展支持率高达99%，而与单子叶植物水稻OsIAA10 isoform2和拟南芥AtIAA31亲缘关系较远，符合物种系统发育关系。序列比对表明GmIAA9与多个豆科及相关物种Aux/IAA家族成员（包括大豆生长素诱导蛋白AUX22、豇豆生长素诱导蛋白22A等）具有80.59%的序列相似性，进一步支持其在豆科植物中的进化保守性。

**3.2 GmIAA9过表达烟草的鉴定**

研究采用异源表达策略，将35S::GmIAA9-GFP表达载体转化至pRI101-GFP烟草中。PCR鉴定结果显示转基因植株中可检测到GmIAA9基因特异性条带，而空载体对照无相应信号。基于此筛选出3个纯合过表达株系（GmIAA9-1、GmIAA9-2、GmIAA9-4）用于后续分析。亚细胞定位结果表明GmIAA9蛋白定位于细胞核，初步证实其作为转录调控因子的功能。

**3.3 低磷胁迫下根系表型分析**

对转基因烟草在低磷处理下的根系构型相关指标分析显示，过表达GmIAA9的烟草在总根长、根表面积和根平均直径方面分别比对照（pRI101-GFP）高25.37%、19.44%和13.58%，多数指标差异达到显著或极显著水平。鲜重测定表明，过表达株系的地上部分鲜重（AFW）、根鲜重（RFW）和总鲜重（TFW）分别比对照增加51.72%、77.92%和54.93%。上述结果表明，GmIAA9过表达不仅改善了根系构型，还显著促进了植物整体生长和生物量积累。

**3.4 低磷胁迫下的生理响应**

叶绿素含量分析显示，低磷胁迫下GmIAA9过表达植株叶片叶绿素a和总叶绿素含量分别比对照组显著高34.84%和9.4%，而叶绿素b降低30.77%。过表达株系根系活力提高349%。低磷处理下，过表达株系叶片氮含量增加6.9%，根系磷含量和氮含量分别增加338%和39.05%。酶活性检测结果表明，低磷条件下过表达株系叶片IAAO、ACP和POD活性分别提高55.45%、32.32%和136%，根系相应酶活性分别提高78.11%、51.58%和74.18%。叶片MDA含量降低53.4%，根系MDA含量降低77.03%。综上，GmIAA9过表达通过光合作用、根系活力、磷吸收效率和抗氧化防御等多种生理途径增强了低磷胁迫耐受性。

**3.5 低磷胁迫下的激素水平变化**

激素含量测定结果显示，低磷胁迫下转基因GmIAA9烟草叶片IAA含量比对照显著提高42.63%，根系IAA含量提高245%；叶片ABA含量比对照显著提高101%，根系ABA含量提高59.35%。而茉莉酸（JA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）在叶片和根系中的含量均未发生显著变化。上述结果表明，GmIAA9过表达主要通过调控生长素和脱落酸信号通路参与低磷胁迫响应。

**3.6 相关性网络分析**

Pearson相关性分析揭示了低磷胁迫下根系和叶片中生长、生理和激素参数之间的复杂互作网络。在根系中，MDA与大多数指标呈显著负相关，但与ABA呈正相关；根长、根表面积和TTC根系活力与养分含量、酶活性、IAA和MeJA呈正相关。在叶片中，叶绿素a与POD、ACP、IAA、ABA和MeJA呈正相关，与MDA呈负相关。这些结果表明GmIAA9过表达协调了促进生长、磷活化和逆境防御的整合生理网络。

**3.7 GmIAA9在低磷胁迫下的表达模式**

qRT-PCR分析显示，低磷胁迫处理可在1小时内快速诱导GmIAA9基因表达，并在7小时达到峰值。在各时间点，转基因株系的表达水平均显著高于pRI101-GFP对照。低磷诱导下，转基因烟草叶片中表达水平比对照提高40.36倍，根中提高11.15倍。值得注意的是，根中的峰值表达量比叶片高1.17倍，表明该基因在响应低磷胁迫时具有显著的根组织偏好性。处理24小时后，叶片和根中的表达水平均呈下降趋势，符合典型的瞬时胁迫诱导表达模式。据此推测，GmIAA9是低磷信号通路中一个早期响应且组织特异性的转录调控因子。

**3.8 转录组分析**

对转基因株系和对照在不同磷处理条件下的根样本进行转录组测序，共获得463,442,287条高质量clean reads，Q20比例在98.76%-99.37%之间，Q30比例在96.97%-98.56%之间，GC含量高于43.12%，测序数据质量良好。主成分分析（PCA）显示样本按基因型聚类，重复性良好。基于筛选标准共鉴定出：未处理条件下（0 h）629个DEGs（457个上调、172个下调）；低磷处理7小时后DEGs增至951个（231个上调、720个下调）；高磷处理7小时后鉴定出325个DEGs（131个上调、194个下调）。韦恩图分析显示8组比较中存在2个核心DEGs。GO功能注释分析表明DEGs最富集于生物学过程，其次是分子功能，细胞组分富集最少。KEGG富集分析显示DEGs显著富集于多个与低磷适应相关的通路，包括植物激素信号转导、苯丙烷生物合成、二萜生物合成、MAPK信号通路-植物等。因此，GmIAA9过表达广泛影响了烟草在不同磷浓度下的转录谱，尤以低磷胁迫诱导的转录变化最为显著。

**4. 讨论总结与研究结论**

根系形态可塑性是植物应对低磷胁迫的重要适应策略之一。本研究发现GmIAA9过表达烟草在低磷胁迫下根系总长度、表面积和体积均显著优于对照，表明该基因通过促进根系发育增强磷吸收能力。这一发现与已有研究一致：拟南芥AtIAA14通过调控侧根形成参与低磷适应，水稻OsIAA11通过影响根冠发育提高磷吸收效率。作为Aux/IAA家族成员，GmIAA9可能通过抑制特定ARF转录因子的活性，解除其对下游生长素响应基因的抑制，从而促进根系形态重塑。值得注意的是，过表达株系根系IAA含量比对照高245%，进一步支持了生长素在GmIAA9介导的根系发育中的核心作用。

低磷胁迫常伴随氧化胁迫，导致膜脂过氧化程度加剧。本研究中GmIAA9过表达烟草叶片和根系MDA含量分别比对照降低53.4%和77.03%，表明该基因能有效缓解低磷诱导的氧化损伤。同时，过表达株系叶片和根系POD活性分别提高136%和74.18%，ACP活性分别提高32.32%和51.58%。ACP活性的升高有利于水解有机磷化合物释放可被植物吸收的无机磷，POD活性的增强有助于清除胁迫诱导的活性氧并维持细胞稳态。此外，IAAO活性在叶片提高55.45%、根系提高78.11%，提示GmIAA9可能通过调控IAA的氧化代谢维持内源生长素的动态平衡。

激素信号网络的交叉对话在植物适应逆境中发挥关键作用。本研究发现低磷胁迫下GmIAA9过表达烟草叶片和根系IAA含量分别提高42.63%和245%，ABA含量分别提高101%和59.35%。相关性分析显示，过表达株系中IAA不仅与ABA呈正相关，还与POD和ACP等抗氧化酶活性呈显著正相关，表明GmIAA9可能协调生长素和胁迫激素信号，构建协同的逆境响应网络。

转录组分析进一步揭示了GmIAA9过表达对下游基因表达的广泛影响。低磷胁迫下DEGs显著富集于苯丙烷生物合成、细胞周期和核质转运等通路。苯丙烷代谢物参与细胞壁加固，相关基因的富集提示GmIAA9可能通过促进细胞壁合成增强根系结构稳定性；细胞周期相关基因的富集与根细胞分裂活性增强一致；核质转运相关通路的富集提示GmIAA9可能影响转录因子等关键调控因子的核质穿梭，从而调控下游胁迫响应基因的表达。此外，在未处理条件下过表达株系即表现出防御反应和萜类代谢相关通路的富集，提示GmIAA9可能赋予植物一种“预激活”状态，使其在遭遇胁迫时能更迅速地启动适应反应。

值得指出的是，本研究在异源表达系统中验证了GmIAA9的功能。烟草虽具有转化效率高、生长周期短等优势，但烟草（茄科）与大豆（豆科）在基因组结构和生理特性上存在显著差异，磷信号通路的进化保守性也可能存在差异。异源系统中观察到的表型可能无法完全反映该基因在大豆原生系统中的功能，缺少与GmIAA9互作的同源ARF蛋白也可能影响调控网络的完整性。因此，GmIAA9在大豆中的功能仍需通过同源过表达和基因敲除等方法进一步验证。研究人员已构建了大豆GmIAA9过表达载体和CRISPR-Cas9基因编辑载体，计划通过大豆同源转化系统快速验证其在磷胁迫响应中的功能。

综上所述，本研究从大豆磷高效近等基因系中克隆并鉴定了GmIAA9，通过烟草异源过表达系统系统研究了其功能。研究结果表明，GmIAA9编码一个定位于细胞核的亲水性蛋白，在豆科植物中进化保守。GmIAA9过表达显著改善了烟草根系构型，增加了总根长、根表面积和根体积，同时增强了低磷条件下的磷吸收能力，提高了酸性磷酸酶和过氧化物酶活性，增加了根系活力并减轻了氧化损伤。激素分析表明GmIAA9促进根和叶片中IAA和ABA的积累，提示其参与生长素和脱落酸信号通路。GmIAA9在低磷处理后1小时内被快速诱导且具有根组织偏好性，7小时达到峰值，表明其作为早期响应转录调控因子的角色。转录组分析进一步揭示GmIAA9调控富集于苯丙烷生物合成、细胞周期和核质转运通路的基因，涉及多种协调机制参与低磷适应。这些来自异源烟草系统的研究结果表明，GmIAA9通过协调调控根系发育、磷活化、抗氧化防御和激素信号传导增强低磷耐受性，为大豆磷高效育种提供了候选基因和理论依据。然而，GmIAA9在大豆原生系统中的功能仍需通过同源过表达和基因编辑方法进行进一步验证。该研究论文发表于《Plant Stress》。