miR-6615-3p-雄激素受体轴通过MDM2-p53-BCL2通路调控鸡等级前卵泡颗粒细胞命运

《Poultry Science》：miR-6615-3p-Androgen Receptor Axis Modulates Granulosa Cell Fate via the MDM2-p53-BCL2 Pathway in Hen Prehierarchical Follicles

　　

微小RNA（miRNAs）通过调节颗粒细胞（GCs）的自噬、凋亡和类固醇生成，在卵泡发育和闭锁调控中发挥关键作用。然而，特定miRNA在这些过程中的作用仍知之甚少。本研究聚焦miR-6615-3p，探讨其在鸡等级前卵泡颗粒细胞（PFGCs）中的功能及分子机制。通过qRT-PCR确认了miR-6615-3p在鸡PFGCs中的表达。双荧光素酶报告实验鉴定雄激素受体（AR）基因为miR-6615-3p的直接靶标。功能分析揭示，miR-6615-3p抑制AR表达，促进凋亡，并抑制PFGCs中的自噬和类固醇生成。综上，这些结果表明miR-6615-3p下调AR，并与MDM2表达降低、p53活化增强及BCL2表达减少相关。这提示其可能至少部分通过MDM2-p53-BCL2信号通路调控细胞命运和类固醇激素合成。本研究为鸡卵泡发育的分子机制提供了新见解，并突出miR-6615-3p作为改善家禽繁殖性能的潜在分子标记。

**miR-6615-3p-雄激素受体轴调控鸡等级前卵泡颗粒细胞命运的分子机制研究解读**

**一、研究背景与科学问题**

在蛋鸡生产中，产蛋性能很大程度上取决于卵巢中等级前卵泡（PFs）的正常发育与选择。卵泡生长发育过程中，大部分卵泡发生闭锁，仅有少数卵泡能够成熟并排卵。颗粒细胞（GCs）通过平衡自噬与凋亡，在卵泡募集、选择、闭锁、成熟和排卵的整个过程中发挥 pivotal 的调控作用。颗粒细胞分泌的类固醇激素，尤其是雌二醇（E2）和孕酮（P4），可调节颗粒细胞的增殖与凋亡，进而影响卵泡发育。等级前卵泡颗粒细胞（PFGCs）处于卵泡发育的起始阶段，直接决定卵泡是否具有向等级阶段发展的潜力。微小RNA（miRNAs）在鸟类卵巢发育调控中发挥关键作用，包括卵泡发育、闭锁和排卵，它们通过调节类固醇激素产生参与多种细胞过程。研究人员前期对罗曼褐蛋鸡LWF、SYF和LYF的测序分析发现，miR-6615-3p存在差异表达，其表达随卵泡阶段进展而升高，提示其参与卵泡选择和颗粒细胞命运决定。然而，miR-6615-3p是否通过AR及MDM2-p53-BCL2通路调控PFGC功能尚不清楚。

雄激素受体（AR）作为一种核受体和转录因子，介导雄激素驱动的卵巢卵泡生长。研究表明，雄激素缺乏显著抑制卵泡发生，而过量雄激素则通过额外的卵巢介质导致多囊卵巢综合征。p53信号通路通过BCL2家族蛋白调节凋亡，并与AR功能相关联。在卵巢中，MDM2通过促进p53降解负调控p53，而活化的p53抑制抗凋亡蛋白BCL2，从而促进凋亡。然而，AR是否通过MDM2-p53-BCL2信号通路调控鸡卵巢中的卵泡自噬、凋亡和类固醇生成仍不清楚。

因此，本研究聚焦于阐明miR-6615-3p靶向AR基因调控鸡PFGCs自噬、凋亡和类固醇生成的分子机制，为揭示miRNA在鸡卵泡发育中的调控作用提供新见解，并鉴定优化家禽繁殖性能的潜在分子标记。

**二、主要技术方法**

本研究主要采用以下关键技术方法：

1. **样本来源**：选用80只210日龄罗曼褐蛋鸡（来自吉林农业大学育种基地），采集1.0-3.9 mm、4.0-5.9 mm和6.0-8.0 mm三个直径范围的等级前卵泡，分别对应小白卵泡（SWF）、大白卵泡（LWF）和小黄卵泡（SYF）的关键发育阶段。卵泡用于RNA提取或颗粒细胞及膜细胞分离培养。
2. **qRT-PCR**：采用茎环RT-PCR法检测miRNA表达，SYBR Green法检测mRNA表达，以U6（miRNA）和β-actin（mRNA）作为内参。
3. **双荧光素酶报告基因分析**：在293T细胞中将含miR-6615-3p结合位点的AR基因野生型（WT）和突变型（MT）3′-UTR序列克隆至pmirGLO载体，验证miR-6615-3p与AR的直接靶向关系。
4. **Western Blot**：检测AR、p53、MDM2、BCL2等蛋白表达水平，以GAPDH和β-actin作为内参蛋白。
5. **流式细胞术**：使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒评估颗粒细胞凋亡率。
6. **透射电子显微镜（TEM）**：观察自噬体形成情况。
7. **ELISA**：检测细胞培养上清液中E2和P4浓度。

**三、研究结果**

**1. miR-6615-3p和AR在PFGCs中的表达模式**

通过qRT-PCR检测发现，miR-6615-3p和AR在不同卵泡大小组的PFGCs中表达水平存在显著差异（P < 0.05）。miR-6615-3p在6.0-8.0 mm卵泡的PFGCs中表达水平显著高于较小卵泡，而AR表达在1.0-3.9 mm卵泡中最高，4.0-5.9 mm次之，6.0-8.0 mm最低。结果表明，随着鸡PFGCs增殖和分化的进展，miR-6615-3p表达逐渐升高，AR基因mRNA表达逐渐降低，提示二者在转录水平参与PFGCs发育调控。

**2. 鉴定和验证AR为miR-6615-3p的直接靶标**

通过miRDB、DIANA和TargetScan数据库预测miR-6615-3p的靶基因，鉴定AR为候选靶基因。双荧光素酶报告实验证实，外源miR-6615-3p显著降低转染AR-WT的293T细胞荧光素酶活性（P < 0.05），而对AR-MT无显著影响。功能验证显示，miR-6615-3p mimic转染显著下调AR mRNA和蛋白表达，而miR-6615-3p inhibitor则显著上调AR表达（P < 0.05）。

**3. miR-6615-3p靶向AR抑制PFGCs自噬**

检测自噬标志基因ATG5、LC3-I、LC3-II和Beclin1的表达，结果显示miR-6615-3p mimics显著下调这些基因的转录水平，而miR-6615-3p inhibitor则上调其表达（P < 0.05）。透射电镜观察显示，miR-6615-3p inhibitor转染组自噬体数量显著增加（P < 0.05）。AR过表达载体共转染实验表明，AR过表达可减弱miR-6615-3p mimics对自噬相关基因的抑制作用（P < 0.05）。这些数据表明miR-6615-3p通过直接靶向AR抑制鸡PFGCs自噬。

**4. miR-6615-3p靶向AR促进PFGCs凋亡**

qRT-PCR检测凋亡标志基因表达，miR-6615-3p mimics转染显著增加CASP3 mRNA表达并降低BCL2表达，而miR-6615-3p inhibitor则产生相反效应（P < 0.05）。流式细胞术分析表明，miR-6615-3p mimic转染组凋亡细胞数量显著增加（P < 0.05）。拯救实验显示，AR过表达可减弱miR-6615-3p mimic的促凋亡效应（P < 0.05）。这些结果证明miR-6615-3p通过直接靶向抑制AR表达促进鸡PFGCs凋亡。

**5. miR-6615-3p靶向AR抑制PFGCs类固醇生成**

检测类固醇生成相关基因FSHR、HSD3B、CYP11A1和STAR的表达，miR-6615-3p mimics显著下调这些基因的mRNA表达，而miR-6615-3p inhibitor显著增强其表达（P < 0.05）。ELISA检测显示，miR-6615-3p mimics显著降低P4和E2分泌水平，而miR-6615-3p inhibitor显著增加其分泌（P < 0.05）。共转染实验表明，AR过表达减弱了miR-6615-3p mimics对类固醇生成标志基因表达的抑制作用（P < 0.05）。

**6. miR-6615-3p通过MDM2-p53-BCL2通路靶向AR调控颗粒细胞命运**

qRT-PCR和Western blot检测MDM2、p53和BCL2的表达。miR-6615-3p mimics在mRNA和蛋白水平均显著增强p53表达，同时显著降低MDM2和BCL2表达（P < 0.05）。miR-6615-3p inhibitor则产生相反效果（P < 0.05）。拯救实验显示，单独AR过表达显著降低p53并上调MDM2和BCL2蛋白表达，而AR与miR-6615-3p共过表达则显著恢复并上调p53蛋白水平，同时MDM2和BCL2蛋白表达显著下降但仍高于对照组（P < 0.05）。这些结果表明miR-6615-3p靶向AR，通过下调MDM2解除对p53的抑制，增强p53对BCL2的负调控，从而调节鸡PFGCs的凋亡、自噬和类固醇生成。

**四、讨论与结论**

研究结果表明，miR-6615-3p在卵泡选择阶段（6.0-8.0 mm）表达升高，而AR在早期卵泡（1.0-3.9 mm）表达最高，二者在卵泡各阶段呈显著负相关。这一动态表达模式提示miR-6615-3p可能作为卵泡发育过程中的分子开关，通过抑制AR表达及其下游信号通路发挥作用。miR-6615-3p通过直接靶向AR基因3′-UTR抑制AR蛋白表达，进而抑制自噬相关基因（ATG5、LC3-I/II、Beclin1）及自噬体形成，促进颗粒细胞凋亡，并下调类固醇生成基因（FSHR、HSD3B、CYP11A1、STAR）表达，减少E2和P4分泌。在机制层面，AR过表达显著上调MDM2表达而下调p53表达，导致BCL2表达增加，提示AR通过激活MDM2-p53-BCL2轴促进颗粒细胞存活。而miR-6615-3p过表达通过靶向AR下调MDM2表达，解除对p53的抑制，使p53表达恢复并上调，BCL2表达显著下降。值得注意的是，尽管BCL2下调理论上应解除对Beclin1的抑制而促进自噬，但miR-6615-3p仍显著抑制了自噬相关基因并减少自噬体形成。这一现象可通过p53的上下文依赖性功能来解释：在鸡PFGCs中，p53活化优先倾向于促进凋亡而非自噬，CASP3上调和BCL2下调即为证据。此外，ATG5和LC3作为自噬体延伸和成熟的关键因子受到抑制，足以阻断自噬通量。

本研究的结论为：miR-6615-3p在鸡等级前卵泡颗粒细胞中呈阶段特异性上调。通过直接靶向AR，miR-6615-3p抑制自噬和类固醇生成，同时促进凋亡，这一过程与MDM2-p53-BCL2轴相关联，从而调控早期卵泡发育和选择。这些发现表明miR-6615-3p可作为改善家禽繁殖性能的潜在分子标记。本研究为理解鸡卵泡发育的分子机制提供了新见解，也为家禽繁殖性能的遗传改良奠定了基础。