《Virulence》：IGFBP7 induces phenotypic shift from platelet-mediated autoagglutination to rosetting of Plasmodium knowlesi-infected erythrocytes
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摘要
由诺氏疟原虫（*Plasmodium knowlesi*）引起的人畜共患疟疾是一种新发传染病，在过去二十年中持续在东南亚地区传播。这种人畜共患病可引起潜在危及生命的血液学并发症，如血小板减少症。虽然疟疾诱导的急性血小板减少症背后的机制仍有待完全阐明，但据
摘要
由诺氏疟原虫（*Plasmodium knowlesi*）引起的人畜共患疟疾是一种新发传染病，在过去二十年中持续在东南亚地区传播。这种人畜共患病可引起潜在危及生命的血液学并发症，如血小板减少症。虽然疟疾诱导的急性血小板减少症背后的机制仍有待完全阐明，但据认为其与疟原虫感染红细胞（IRBC）对血小板的细胞黏附有关。值得注意的是，血小板介导的IRBC细胞黏附可导致IRBC的血小板介导团块形成，也称为IRBC自身凝集。然而，大多数自身凝集研究均以恶性疟原虫（*P. falciparum*）为对象开展。在本研究中，研究人员表征了诺氏疟原虫和恶性疟原虫的自身凝集现象，并探讨了IRBC自身凝集与玫瑰花结形成率（另一种IRBC细胞黏附现象）之间的关系。研究发现，自身凝集依赖于人血清和血小板的存在，其中血小板的存在有利于IRBC发生自身凝集而非玫瑰花结形成。诺氏疟原虫和恶性疟原虫的自身凝集均由CD36介导，其中抗CD36抗体阻断可抑制自身凝集并驱使IRBC与未感染红细胞（URBC）形成更多玫瑰花结。抗P-选择素抗体阻断仅降低恶性疟原虫的自身凝集，对玫瑰花结形成率无影响。值得注意的是，IGFBP7（一种促进II型玫瑰花结形成的人源蛋白）的存在抑制了自身凝集，同时刺激了IRBC的玫瑰花结形成率。鉴于IGFBP7能够改变疟原虫介导的自身凝集与玫瑰花结之间的细胞黏附动态平衡，这种人类蛋白可能改变疟疾的病理生物学，从而影响感染的疾病结局。
关键词：疟疾；自身凝集；玫瑰花结；诺氏疟原虫；恶性疟原虫；IGFBP7
**研究背景与问题**
疟疾作为一种严重威胁全球公共卫生的寄生虫病，其致病机制涉及多种复杂的宿主-寄生虫相互作用。由诺氏疟原虫（*Plasmodium knowlesi*）引起的人畜共患疟疾是东南亚地区过去二十年间持续传播的新发传染病，给受影响国家的疟疾消除工作带来了显著挑战。与许多引起无症状感染或轻微症状的人畜共患病不同，诺氏疟疾具有潜在致命性，即使低寄生虫血症病例也可出现严重并发症。在诺氏疟疾患者中最常报告的并发症之一是血小板减少症，其发生机制尚未完全阐明。现有证据表明，疟原虫感染红细胞（IRBC）与血小板之间的相互作用在疟疾的免疫病理生物学中发挥关键作用。血小板可介导多个IRBC形成稳定团块，即IRBC自身凝集现象，这是有别于玫瑰花结形成（IRBC与未感染红细胞（URBC）的稳定结合）的另一种循环系统内IRBC细胞黏附现象。以往对自身凝集的研究主要集中于恶性疟原虫（*P. falciparum*），而诺氏疟原虫IRBC自身凝集的生物学特征仍未得到充分解析。值得注意的是，胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）可通过与血小板反应蛋白-1（TSP-1）和血管性血友病因子（VWF）的复杂相互作用介导玫瑰花结形成，而这两种分子也是介导血小板黏附的关键因子。然而，玫瑰花结形成与自身凝集在疟疾发病机制中的关系此前一直不清楚。因此，系统表征诺氏疟原虫IRBC的自身凝集现象，并阐明IGFBP7对两种细胞黏附表型平衡的影响，对于深入理解疟疾的病理机制具有重要意义。
**研究内容与结论**
研究人员以诺氏疟原虫A1-H.1株和恶性疟原虫3D7株为研究对象，系统表征了IRBC自身凝集对血小板和人血清的依赖性，鉴定了介导自身凝集的关键受体分子，并重点探讨了IGFBP7对IRBC自身凝集与玫瑰花结形成之间平衡的调控作用。研究发现，IRBC自身凝集显著依赖于血小板和人血清的存在，且恶性疟原虫的自身凝集率显著高于诺氏疟原虫。在血清供给条件下，血小板的存在降低了玫瑰花结形成率。相关性分析显示，诺氏疟原虫的自身凝集率与玫瑰花结形成率呈显著正相关，而恶性疟原虫则无显著相关性。抗体阻断实验揭示，CD36介导了两种疟原虫的IRBC自身凝集，阻断CD36可抑制自身凝集并同时促进玫瑰花结形成；P-选择素仅参与恶性疟原虫的自身凝集。关键的是，IGFBP7的存在显著抑制了两种疟原虫的IRBC自身凝集，同时刺激了玫瑰花结形成率，即使在无血小板环境中IGFBP7也能直接促进玫瑰花结形成。该研究首次描述了诺氏疟原虫-IRBC的血小板介导自身凝集现象，揭示了IGFBP7作为人类来源蛋白能够改变疟原虫介导的细胞黏附动力学平衡，从自身凝集偏向玫瑰花结形成，这一发现可能对疟疾的病理生物学和疾病结局产生重要影响。该研究成果发表在《Virulence》期刊。
**主要技术方法**
本研究采用了以下关键技术方法：诺氏疟原虫A1-H.1株和恶性疟原虫3D7株的连续体外培养体系，使用MACS磁性活化细胞分选器富集晚期阶段寄生虫；吉姆萨湿封片法结合光学显微镜（1000×放大）进行玫瑰花结形成率（200个IRBC）和自身凝集率（500个IRBC）的定量评估，采用半盲法设计并由独立训练评估者计分，评估者间一致性通过组内相关系数（ICC > 0.90）验证；通过添加外源血小板和不同浓度人血清（0%、10%、20%）检测自身凝集和玫瑰花结形成的依赖性；抗体阻断实验使用抗CD36、抗P-选择素和抗PECAM-1（CD31）抗体鉴定参与自身凝集的受体分子；重组人IGFBP7蛋白处理实验检测其对两种细胞黏附表型平衡的影响。所有实验均设八组独立生物学重复。
**研究结果**
**血小板和人血清是IRBC自身凝集的必要条件**：通过三因素方差分析发现，IRBC自身凝集率显著依赖于血小板（p < 0.0001）和人血清（p < 0.0001）的可用性，恶性疟原虫的自身凝集率高于诺氏疟原虫（p = 0.0134）。10%与20%血清浓度间的自身凝集率无显著差异。平行检测玫瑰花结形成率发现，其同样显著受血清（p < 0.0001）和血小板（p < 0.0001）影响，血清供给条件下血小板的存在降低了玫瑰花结形成率。简单线性回归分析显示，诺氏疟原虫的自身凝集与玫瑰花结形成率呈显著正相关（R2 = 0.5324，p < 0.0001），而恶性疟原虫两者间无显著相关性（R2 = 0.0849，p = 0.1056）。
**诺氏疟原虫和恶性疟原虫IRBC自身凝集涉及的受体**：抗CD36抗体显著抑制诺氏疟原虫IRBC自身凝集（p = 0.0012），并伴随玫瑰花结形成率升高（p = 0.0193）。P-选择素和PECAM-1抗体阻断对诺氏疟原虫的细胞黏附表型无显著影响。对于恶性疟原虫，抗CD36（p < 0.0001）和抗P-选择素（p = 0.0156）抗体均显著降低自身凝集率，但仅抗CD36抗体引起玫瑰花结形成率显著升高（p = 0.0001）。
**IGFBP7改变IRBC自身凝集与玫瑰花结之间的细胞黏附平衡**：在诺氏疟原虫中，IGFBP7与血小板共孵育显著降低IRBC自身凝集率（p = 0.0001），并在无血小板（p = 0.0005）和有血小板（p < 0.0001）条件下均显著刺激玫瑰花结形成。IGFBP7介导的玫瑰花结促进作用在无血小板与有血小板环境间无显著差异（p = 0.2422）。恶性疟原虫同样观察到IGFBP7介导的自身凝集抑制（p < 0.0001）和玫瑰花结形成率同步升高（p < 0.0001），且血小板的存不影响IGFBP7的玫瑰花结刺激效应（p = 0.5243）。
**讨论与结论**
本研究首次描述了诺氏疟原虫-IRBC的血小板介导自身凝集现象。与恶性疟原虫相似，诺氏疟原虫的IRBC自身凝集依赖血小板和血清源性成分。在疟疾发病过程中，血小板被消耗以促进宿主先天免疫系统清除疟原虫，IRBC自身凝集可能进一步加剧感染期间血小板的消耗和耗竭，导致急性血小板减少症的发生。抗CD36抗体阻断后两种疟原虫的玫瑰花结形成率均升高，提示IRBC自身凝集与玫瑰花结形成竞争共享的寄生虫细胞黏附配体，或同一配体上相邻的结合结构域存在空间位阻效应。P-选择素仅参与恶性疟原虫的自身凝集而不影响其玫瑰花结形成，这可能与恶性疟原虫玫瑰花结的多配体介导特性有关。IGFBP7通过直接刺激IRBC与URBC间的相互作用而非被动抑制血小板介导团块形成，将细胞黏附平衡从自身凝集转向玫瑰花结形成。虽然自身凝集的减少理论上可通过节省血小板储备而保护宿主免受严重血小板减少症的影响，但玫瑰花结形成在以往研究中与重症疟疾相关。因此，IGFBP7介导的表型转变对宿主是保护性还是有害性仍需进一步研究。研究人员也指出，直接竞争结合实验、血小板消耗实验或体内动物研究尚未开展，评估不同疾病严重程度疟疾患者循环IGFBP7水平以及解析IGFBP7与TSP-1和VWF下游分子桥的具体作用机制，是未来研究的重要方向。综上所述，诺氏疟原虫-IRBC的自身凝集是一种由CD36介导的血小板和血清依赖性细胞黏附现象，且与玫瑰花结形成显著相关。对于诺氏疟原虫和恶性疟原虫，IGFBP7的存在均使IRBC的细胞黏附偏好从自身凝集转向玫瑰花结形成，这可能减少宿主血小板因参与IRBC介导的细胞黏附事件而导致的耗竭。
