《Antioxidants》：Genome-Wide Association Study Reveals Novel Loci and Candidate Genes of Vitamin E Content in Sesame (Sesamum indicum L.)
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摘要
芝麻是一种重要的油料作物，其优异的氧化稳定性与其丰富的内源性抗氧化剂密切相关。作为芝麻中最主要的脂溶性抗氧化剂之一，维生素E（VE）在清除脂质过氧自由基、终止脂质过氧化链式反应以及保护细胞膜免受氧化损伤方面发挥着关键作用，从而维持细胞内氧化还原稳态并
摘要
芝麻是一种重要的油料作物，其优异的氧化稳定性与其丰富的内源性抗氧化剂密切相关。作为芝麻中最主要的脂溶性抗氧化剂之一，维生素E（VE）在清除脂质过氧自由基、终止脂质过氧化链式反应以及保护细胞膜免受氧化损伤方面发挥着关键作用，从而维持细胞内氧化还原稳态并减轻氧化应激相关疾病的发展。尽管VE是一种有效的天然抗氧化剂，在缓解氧化应激相关疾病方面具有显著的药理活性，但芝麻中VE含量自然变异的遗传机制仍未被完全阐明。本研究对两个环境下种植的400份芝麻种质资源的VE含量变异进行了评估。超高效液相色谱（UHPLC）分析显示，芝麻种子中仅检测到γ-生育酚，其含量介于169.33至463.31 mg/kg之间，平均值为316.28 mg/kg。研究将全基因组重测序获得的新SNP和InDel数据与表型数据进行关联分析，鉴定出5个与VE含量显著相关的位点。对两份VE含量存在显著差异的芝麻种质进行比较转录组分析，揭示了两份种质之间关键生物合成酶基因（如*GGDR*、*PDS1*、*VTE2*和*VTE4*）的差异表达。通过整合全基因组关联分析与转录组数据，筛选出两个主要候选效应基因*SINPZ1100015/SiNST1*和*SINPZ0901927*，其中*SiNST1*尤为突出。功能验证进一步表明，在芝麻毛状根中过表达*SiNST1*可显著降低VE含量。本研究加深了对芝麻VE含量变异及其生物合成代谢调控机制的理解，为开发用于膳食抗氧化补充的功能型芝麻品种提供了支持。
**芝麻维生素E含量遗传解析研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
芝麻（*Sesamum indicum* L.）是芝麻科中一种重要的油料作物，主要种植于亚洲和非洲的热带及亚热带地区。芝麻种子富含维生素E（VE），其含量可高达50.4 mg/100 g（黑芝麻）。VE作为一种脂溶性维生素，无法在人和动物体内自主合成，需通过膳食摄入。作为一种高效的天然抗氧化剂，VE能够清除活性氧（ROS）诱导的细胞和脂质氧化损伤，抑制脂质过氧化并维持生物膜完整性。ROS产生与抗氧化防御系统之间的失衡会导致氧化应激，而氧化应激是多种人类慢性疾病的共同病理基础。VE具有抗氧化、抗炎活性，并参与抗癌、抗动脉粥样硬化、心脏保护和神经保护等多种健康过程。因此，提高膳食来源的VE含量是通过营养干预改善人类健康的有效策略。
尽管芝麻被公认为富含VE的作物，但调控芝麻VE生物合成的遗传机制仍不明确。VE生物合成途径在高等植物中已通过模式植物拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中关键酶基因的克隆和功能验证逐渐阐明。VE的主要前体包括尿黑酸（HGA）、植基二磷酸（PDP）和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸（GGDP），分别来源于莽草酸途径、叶绿素降解和甲基赤藓醇磷酸途径。核心合成路线涉及4-羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）、尿黑酸植基转移酶（HPT）、2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶（MPBQ MT）、生育酚环化酶（TC）和γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）等多个酶促反应步骤。
随着测序成本的降低，全基因组关联分析（GWAS）已广泛应用于作物复杂农艺性状的遗传解析。GWAS已在油棕、甜玉米、番茄、玉米、油菜、水稻和大豆等多种作物中成功鉴定出与VE含量显著关联的位点。然而，在芝麻中，已有研究受限于样本量小（96份）和多态性位点密度低（5962个位点），难以全面精准地解析芝麻种子VE变异的遗传基础，其自然变异的遗传架构在很大程度上仍属未知。
**二、研究内容与主要结论**
本研究利用两个环境条件下种植的400份芝麻种质资源（包括318份地方品种和82份育成品种），开展GWAS以鉴定调控芝麻VE含量的显著位点和候选基因。研究基于全基因组重测序获得的高密度SNP和InDel标记，结合表型数据进行关联分析，鉴定出5个与VE含量显著相关的稳定位点。通过对VE含量存在极端差异的两份芝麻种质的比较转录组分析，并将GWAS结果与转录组数据整合，发现*SiNST1*是参与VE生物合成的关键调控基因。功能验证表明，在芝麻毛状根中过表达*SiNST1*可显著降低VE含量，证实了其对VE积累的负调控作用。本研究将大规模关联群体、多环境表型鉴定和转录组分析相结合，为解析芝麻VE含量的遗传架构提供了新见解，为开发功能性芝麻品种以进行膳食抗氧化补充奠定了基础。
**三、主要技术方法**
本研究的主要技术方法包括：（1）正相超高效液相色谱（UHPLC）结合外标法测定芝麻种子VE含量；（2）利用三个统计模型——混合线性模型（MLM）、FarmCPU和3VmrMLM进行全基因组关联分析（GWAS），采用位于武汉和临清两个地点的400份芝麻种质资源作为关联群体（来源于中国农业科学院油料作物研究所国家油料作物中期基因库）；（3）对高VE含量（HE）和低VE含量（LE）两份芝麻种质在开花后10、20、30天的种子进行转录组测序及差异表达基因（DEGs）分析；（4）通过同源比对鉴定芝麻VE生物合成途径基因并分析其表达模式；（5）利用发根农杆菌介导的毛状根转化系统进行*SiNST1*基因的过表达功能验证。
**四、主要研究结果**
**4.1 VE含量的统计与变异分析**
对来自武汉和临清两个环境的400份芝麻种质种子VE含量进行分析，结果显示VE含量在自然群体中呈现显著表型变异和正态分布，表明芝麻VE含量是一个受多基因控制的数量性状。武汉环境下VE含量范围为151.59～483.26 mg/kg，平均值为279.17 ± 45.67 mg/kg，变异系数（CV）为16.36%；临清环境下VE含量范围为199.52～523.00 mg/kg，平均值为354.62 ± 62.87 mg/kg，CV为17.73%。两环境平均后，VE含量范围为169.33～463.31 mg/kg，总体平均值为316.28 ± 48.83 mg/kg。相关性分析显示两个环境间VE含量呈显著正相关（相关系数r = 0.58，P < 0.001），表明VE含量具有合理的跨环境一致性，支持了表型数据的可靠性。
**4.2 GWAS鉴定与VE含量相关的显著SNP和InDel**
利用两个环境的VE表型数据和超过130万个位点，采用MLM、FarmCPU和3VmrMLM三种统计模型进行GWAS，共鉴定出71个与VE含量显著关联的位点。其中MLM检测到12个显著位点（9个SNP和3个InDel），主要分布于染色体2、5、7、9、10和11；FarmCPU检测到25个显著位点（22个SNP和3个InDel），分布于所有13条芝麻染色体；3VmrMLM检测到的位点最多，共45个，也分布于全部13条染色体。其中5个在两个环境或多个模型中被重复检测到的位点被确定为核心候选位点。仅SNP11:142842和SNP9:20151495两个位点被所有三种统计模型共同鉴定。显著位点的表型变异解释率（PVE）范围为2.39%～9.2%，其中SNP11:142842位点的贡献最大。优异等位基因效应分析表明，所有5个位点的优异等位基因均有助于增加芝麻VE积累，且随着优异等位基因数量的累积，芝麻VE含量呈逐步上升趋势。
**4.3 VE含量差异芝麻种质的比较转录组分析**
选取成熟种子VE含量显著不同的HE（武汉358.79 mg/kg，临清435.92 mg/kg）和LE（武汉151.58 mg/kg，临清213.79 mg/kg）两份芝麻种质，在开花后10、20、30天三个种子发育关键时期进行比较转录组分析。主成分分析（PCA）显示两份种质在不同发育阶段具有明显不同的基因表达模式。成对差异表达比较分别鉴定出1292（10 DPA）、1203（20 DPA）和3012（30 DPA）个DEGs，其中30 DPA时期的DEGs数量最多，表明种子成熟后期对VE生物合成至关重要。韦恩图分析确定了36个在整个种子发育过程中持续差异表达的基因。KEGG富集分析显示，三个发育阶段均显著富集于苯丙烷生物合成途径；GO分析表明不同发育阶段的DEGs富集于不同的生物学过程。随机选取8个DEGs进行qRT-PCR验证，结果与RNA-seq分析一致，证实了转录组数据的可靠性。
**4.4 VE生物合成途径基因在HE和LE种质种子发育过程中的表达**
通过全基因组同源比对，在芝麻中鉴定出19个编码8种VE生物合成酶的基因。比较分析显示，VE生物合成基因在种子发育早期（10 DPA）无差异表达，但在中后期出现表达差异。其中，*GGDR*、*PDS1*和*VTE2*在20和30 DPA时于HE种子中的转录水平高于LE；而编码γ-TMT的*VTE4*基因在HE中显著下调。这些关键基因的差异表达可能共同促进了HE种质中γ-生育酚的更多积累。
**4.5 VE含量候选基因的鉴定**
在5个可靠关联位点±89 kb连锁不平衡（LD）窗口内提取基因，并与各差异表达基因集取交集，结合基因注释信息筛选出两个候选基因*SINPZ0901927*和*SINPZ1100015*。*SINPZ0901927*长度为3680 bp，编码MYB转录因子；位点SNP9:20151495距离该基因最近，变异等位基因“G”相比常见等位基因“A”可显著提高芝麻种子VE含量（P < 0.01）。*SINPZ1100015/SiNST1*长度为1438 bp，含三个外显子，编码NAC转录因子，其拟南芥同源基因*NST1*是次生壁生物合成的关键转录激活因子。SNP11:142842位于*SiNST1*的第二个外显子中，为非同义突变（苏氨酸→赖氨酸），且在MLM和FarmCPU模型中均表现为最显著关联，并能在两个环境中稳定检测到。变异等位基因“A”相比常见等位基因“C”可极显著提高VE含量（P < 0.0001）。组织表达分析显示*SiNST1*在种子中特异表达，且在种子发育期间LE种质中的表达水平明显高于HE。
**4.6 芝麻毛状根中过表达*SiNST1*降低VE含量**
qRT-PCR分析确认了*SiNST1*在种子发育早期的表达水平显著高于后期，且在整个种子发育过程中LE的表达量明显高于HE。在35S启动子驱动下于芝麻转基因毛状根中过表达*SiNST1*，获得两个过表达株系（OE1和OE2）。UHPLC测定显示，*SiNST1*-OE毛状根系的VE含量（124.63～176.66 mg/kg）显著低于空载体对照（VC），表明*SiNST1*对芝麻VE含量具有负调控作用。
**五、讨论与结论**
讨论部分围绕VE在油料作物中的含量特征、HE与LE种质的转录组分析、转录因子介导的VE代谢调控以及*SiNST1*的多效性调控作用展开。不同油料作物中VE形式和含量存在差异，芝麻种子以γ-生育酚为主（占95%以上），且γ-生育酚的抗氧化功效优于α-生育酚，凸显了芝麻作为天然脂溶性抗氧化剂来源的优越性。转录组分析表明，*VTE4*及*GGDR*、*PDS1*、*VTE2*等关键酶基因的差异表达可能是芝麻种质间VE含量变异的主要原因。MYB和NAC转录因子可能通过系统调控植物抗氧化网络间接影响VE生物合成。*SiNST1*被证明与芝麻多种营养和结构性状相关，包括含油量、脂肪酸组成、种皮厚度、蛋白质、植物甾醇和木脂素含量等，其对VE积累的负调控作用及其多效性使其成为通过标记辅助育种优化芝麻营养和抗氧化特性的有前景的靶标。
研究结论指出，本研究鉴定了400份芝麻种质在两个环境下的VE含量变异，揭示了环境对VE积累的显著影响；鉴定出5个与VE含量显著关联的位点，有助于芝麻的遗传选择和品质改良；通过整合GWAS、基因注释和转录组数据，确定了两个主要候选效应基因*SINPZ1100015/SiNST1*和*SINPZ0901927*，其中*SiNST1*尤为关键。这些发现为解析芝麻VE生物合成调控的分子机制奠定了基础，为选育高VE含量品种提供了宝贵的遗传资源。未来研究应优先开展多年多环境验证，并通过基因编辑技术靶向改造*SiNST1*以进一步提高芝麻种子γ-生育酚水平。
