《Cells》：Extracellular Vesicle-Mediated Macrophage Polarization in Sepsis-Induced Acute Lung Injury: Molecular Mechanisms and Therapeutic Opportunities
脓毒症诱导的急性肺损伤（SI-ALI）是脓毒症的严重并发症，其特征为失控的炎症反应和免疫稳态受损。越来越多的证据表明，细胞外囊泡（EVs），特别是外泌体（exosomes），是细胞间通讯的重要介质。尽管脓毒症潜在的感染源具有异质性，但EVs可通过转移多种生物活性货物（cargo）来调控巨噬细胞极化和功能重编程。因此，EVs参与了不同病因所致脓毒症引发的SI-ALI的病理生理进程。然而，不同的EV货物调控巨噬细胞功能并促成SI-ALI发病机制的具体机制仍未完全阐明。为解决上述问题，本综述总结了不同EV亚型及其货物（包括RNA、蛋白质、脂质和DNA）如何通过多种信号通路调节巨噬细胞功能状态。上述过程进一步影响了SI-ALI所致急性肺损伤中的炎症反应、免疫平衡和组织再生。特别值得注意的是，EV介导的巨噬细胞功能调控超越了僵化的M1/M2二分法，而是基于涉及促炎反应、免疫调节及组织再生的动态功能谱系。本文最后总结了基于EV的治疗方法，旨在实现货物递送或阻断，并探讨了转化医学相关的主要问题。总体而言，本综述阐明了由EVs调控的巨噬细胞调控网络，有助于理解SI-ALI的免疫病理机制，并为开发基于EVs的精准医学奠定理论基础。
1. 引言
脓毒症是由宿主对感染的反应失调引起的疾病综合征，其特征为免疫系统功能障碍、过度炎症和多器官功能障碍。尽管重症监护领域取得了诸多进展，脓毒症仍是全球危重症患者死亡的主要原因之一。在受脓毒症影响的器官中，肺因其特殊结构和丰富的免疫细胞而尤为脆弱。脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）及其更严重的形式——急性呼吸窘迫综合征（ARDS），是导致脓毒症患者呼吸衰竭和死亡的重要因素。ARDS不仅可由脓毒症诱发，也可由创伤、大量输血等因素触发。然而，在脓毒症情况下，ARDS的发生与未控制的感染和炎症高度相关。从病理生理学角度看，脓毒症诱导的ALI涉及肺泡-毛细血管屏障功能受损、严重炎症、血管通透性增高及弥漫性肺泡损伤。目前，SI-ALI的治疗方案包括感染防控、器官支持和肺保护性措施；然而，尚无直接针对免疫功能障碍和组织损伤等潜在病理过程的治疗方法。因此，阐明驱动脓毒症诱导ALI的分子机制对于发现新的治疗靶点和促进精准治疗的发展至关重要。
脓毒症可由不同解剖部位的感染及不同病原体引起，主要感染来源包括肺部、腹腔、泌尿系统、血流以及皮肤和软组织感染。不同感染源具有各自的生物学特征，可能诱导不同程度的炎症、血管功能障碍、凝血紊乱和免疫代谢改变。然而，无论感染来源或病原体如何，脓毒症均以宿主对感染反应失调为特征，并可通过全身炎症和免疫功能障碍的发展诱发肺损伤。在这一过程中，巨噬细胞作为重要的免疫效应细胞，参与病原体清除、炎症调控和组织再生。其功能活动持续受到病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）、细胞因子和代谢改变的调节。越来越多的数据表明，EVs尤其是外泌体，作为信号载体参与调控巨噬细胞极化和功能性编程。因此，即使不同感染源导致宿主产生不同的反应模式，EVs诱导的巨噬细胞极化和功能性编程仍是各种病因SI-ALI中两种常见且重要的免疫调节机制。
然而，关于EVs在脓毒症诱导ALI过程中调控巨噬细胞功能的详细分析尚不多见。以往研究主要聚焦于单个EV货物所发挥的调节作用，但不同EV亚群及其多样化货物对巨噬细胞功能的影响尚未得到广泛研究。EVs对巨噬细胞活性的调节涉及炎症、组织损伤、屏障功能障碍和细胞死亡等多种病理过程。此外，EVs的货物可能因脓毒症微环境的不同而对巨噬细胞功能产生不同程度的影响。外泌体中各分子在调节疾病进程中的相对重要性在多大程度上由免疫反应的局部微环境决定，目前仍不清楚。同时，当前多数研究仍沿用经典的M1/M2分类，这不能完全反映巨噬细胞在SI-ALI中的异质性和可塑性。采用更全面的视角对于深入理解EVs介导的巨噬细胞调控至关重要。尽管将EVs用作治疗制剂和载体已引起广泛关注，但体内分布、靶向性和生产等问题仍阻碍其临床应用。
为填补上述知识空白，本综述聚焦于SI-ALI中EV介导的巨噬细胞极化与功能性重编程。首先讨论SI-ALI过程中巨噬细胞的功能异质性和动态变化；随后总结不同EV亚型及其功能性货物调控巨噬细胞状态的分子机制，并探讨在不同脓毒症微环境条件下各类货物的相对贡献；在此基础上，分析EV介导的巨噬细胞调控如何影响炎症与免疫稳态、肺组织修复、肺泡-毛细血管屏障完整性及程序性细胞死亡；最后讨论涉及靶向致病性EVs和应用保护性及工程化EVs的潜在治疗策略。
2. 脓毒症诱导ALI中的巨噬细胞极化
巨噬细胞是先天免疫系统的重要效应细胞，在病原体清除、炎症调节和组织稳态维持中发挥核心作用。肺组织中的常驻巨噬细胞主要包括肺泡巨噬细胞（AMs）和间质巨噬细胞。AMs主要分布于肺泡腔，构成肺抵御外来病原体的第一道免疫屏障，负责识别、吞噬和清除吸入性病原体，同时调节局部炎症反应。间质巨噬细胞主要分布于肺间质和血管周围区域，其功能主要是维持免疫稳态、调节炎症和介导组织重塑。尽管两类巨噬细胞在解剖分布和功能定位上存在差异，但均表现出显著的功能可塑性，并通过协同调节免疫反应共同参与脓毒症诱导ALI的发生和进展。
巨噬细胞功能失调是SI-ALI中免疫紊乱的关键组成部分。经典的M1/M2模型通常将巨噬细胞分为促炎性M1型和抗炎性M2型，为描述巨噬细胞在不同刺激条件下的反应提供了简化框架。然而，这种二分法不能完全反映巨噬细胞在体内的复杂性。M1和M2主要代表在特定实验条件下建立的典型活化状态。相比之下，组织微环境中的巨噬细胞同时暴露于多种刺激，包括病原体相关信号、细胞因子、损伤相关信号和代谢改变，从而呈现出具有不同转录和功能特征的细胞状态。除典型的M1样和M2样表型外，还存在同时表现出促炎、免疫调节或组织修复特征的混合型和中间态。M0主要作为体外无特定极化刺激时的参考状态，并不对应体内稳定存在的独立巨噬细胞亚群。因此，将巨噬细胞严格分为相互排斥的M1或M2两种类型不足以反映其体内的功能状态。具体而言，巨噬细胞的功能状态代表一种由多条信号通路共同调控的动态功能程序，可随疾病进展和局部微环境变化而持续重塑。
这种异质性在SI-ALI的疾病进展中更为显著。感染后，PAMPs和DAMPs可快速激活肺巨噬细胞。促炎信号通路——如TLR/NF-κB、MAPK和NLRP3——被放大，导致TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症介质随后释放。在此阶段，促炎功能通常占主导地位，细胞可能表现出经典的M1样特征。然而，M1样巨噬细胞并非感染早期唯一存在的类型。脓毒症中的促炎和抗炎反应可在早期同时触发，具有M2或免疫调节特征的巨噬细胞也可能同时存在。因此，不同功能程序之间不存在严格的时间界限，其相对强度可能因感染负荷、组织损伤程度和局部免疫环境而异。
随着促炎反应的持续加剧，巨噬细胞释放的炎症介质可促进中性粒细胞的募集和活化。这会加剧肺泡上皮和血管内皮的损伤，导致肺泡-毛细血管屏障破坏、肺水肿和气体交换障碍。此外，在CLP诱导的脓毒症模型中，肺泡巨噬细胞促炎表型的增强与肺炎症和组织损伤加重相关。同时，LPS和IFN-γ联合刺激同样可诱导显著的M1样特征并维持促炎介质的表达。因此，虽然巨噬细胞的促炎功能有助于病原体清除和宿主防御，但其持续或过度激活也会放大肺部炎症并加重组织损伤。
随着脓毒症的进展，巨噬细胞微环境持续变化，导致巨噬细胞表型和功能发生动态适应。PAMPs和DAMPs的持续存在维持促炎信号传导，而IL-10、TGF-β以及凋亡细胞清除信号则有助于增强免疫调节和组织修复过程。在此阶段，部分巨噬细胞保留较强的促炎特征，而另一些则增加IL-10和Arg1等免疫调节因子的产生。当后者相对增强时，巨噬细胞有助于限制过度炎症、清除凋亡细胞并促进肺组织修复。此外，如果感染得到控制且组织损伤逐渐消退，这些功能将促进炎症消退和肺泡-毛细血管屏障的恢复。如果感染持续存在或免疫失衡未能纠正，则可能发生持续性炎症和进行性组织损伤。因此，在SI-ALI中观察到的巨噬细胞反应无法通过M1和M2极化之间离散或明确的转变阈值来充分表征。相反，巨噬细胞在疾病进展过程中具有动态调控的功能程序，涵盖促炎反应、免疫调节和组织修复。（图1）
基于此，本综述后续关于EV介导巨噬细胞调控的讨论并非仅基于传统的M1/M2极化范式，而是综合考虑EVs对巨噬细胞的整体功能影响，例如对炎症反应、免疫稳态和组织修复的控制。这种功能视角能够更深入地理解SI-ALI中EV-巨噬细胞相互作用的多面性和动态性。
3. EVs的生物学特性与免疫调节功能
EVs是一类异质性的膜结合囊泡，其生物发生、分子组成和生物学特性各异。起源细胞和微环境条件影响其组成和功能特性。通过交换生物活性分子，不同EV群体可调节受体细胞的活性，从而影响广泛的生理和病理过程。因此，本节首先概述EVs的主要类型及其生物学特征，随后重点介绍外泌体的生物学特性和免疫调节功能，为深入探讨EVs介导巨噬细胞极化调控的机制奠定基础。
3.1. EVs的分类
根据其形成机制、来源和生物学特征，EVs通常分为几个主要类型，包括外泌体、微囊泡（MVs）和凋亡小体（apoptotic bodies）。外泌体因其明确的生物发生途径、相对清晰的分子组成和广泛的功能适用性，是研究SI-ALI中EV介导过程时研究最多的EV类型。外泌体是通过内体途径主要通过多泡体（MVBs）的形成而产生的小型EVs。在外泌体生物发生过程中，质膜内陷形成早期内体，随后发展为晚期内体和MVBs。MVBs与质膜融合后将腔内囊泡释放到细胞外空间，即为外泌体。外泌体直径通常为30-150 nm，含有高度富集多种功能性生物分子（如蛋白质、脂质和核酸）的脂质双层膜。这些特性使外泌体能够参与细胞间通讯并调节受体细胞的生物活性。
微囊泡主要通过细胞膜直接出芽形成，通常比外泌体大，直径约为100-1000 nm。与外泌体不同，微囊泡的形成更依赖于细胞膜重塑和细胞骨架的变化。相关研究表明，微囊泡可携带膜蛋白、脂质和核酸分子，参与炎症反应调节、细胞迁移和血管功能变化等过程。
凋亡小体主要来源于程序性细胞死亡过程中形成的膜结合结构，直径约为1-5 μm，可能含有细胞器片段、DNA、蛋白质等成分。尽管目前关于凋亡小体在SI-ALI中的研究有限，但其在死亡细胞清除、免疫耐受建立和炎症调节中的潜在作用正逐渐受到关注。
在脓毒症相关急性肺损伤（ALI）期间，感染性刺激和炎症微环境变化可诱导免疫细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞释放EVs。这些EVs可携带核酸、蛋白质和脂质等生物活性分子，影响炎症细胞募集、免疫反应调节和肺组织修复过程。
各种类型的EVs均参与细胞间通讯，通过携带蛋白质、脂质和核酸等功能性货物调节受体细胞的功能。然而，目前关于脓毒症相关ALI中EV介导免疫调节的研究仍主要集中在外泌体。由于外泌体起源于内体-多泡体途径，其生物发生和相关调控机制已被深入研究；同时，它们具有相对稳定的膜结构和完善的鉴定体系。大量研究表明，外泌体可通过递送多种功能分子参与免疫细胞功能的调节，尤其在巨噬细胞的炎症反应和表型重塑中发挥关键作用。因此，本文后续将聚焦于EV介导的巨噬细胞极化调控，重点分析外泌体货物影响巨噬细胞功能重塑的机制。
3.2. 外泌体的生物学特征
外泌体是目前研究最广泛的EV亚型。其生物发生、膜结构和货物组成共同决定了其细胞间递送和调控特性。外泌体具有脂质双层膜，可保护其分子货物免受酶解降解，从而增强其稳定性并实现长距离细胞间通讯。外泌体包裹多种生物活性货物，包括miRNAs、lncRNAs、circRNAs、蛋白质和脂质。这些货物的组成随供体细胞的来源和生理状态而变化，这种差异赋予外泌体不同的生物学特性。
尽管CD9、CD63、CD81、TSG101和Alix仍是最广泛使用的外泌体鉴定标志物，但近年来的研究已从表型表征转向外泌体内部货物的功能异质性。近期研究表明，外泌体的生物学效应不仅与其表面特征有关，还受其内部功能货物组成及其相互作用模式的影响。
3.3. 外泌体的免疫调节功能
外泌体不仅充当细胞间通讯的载体，还是免疫微环境的关键调节因子。通过递送多种生物活性货物，它们协调先天性和适应性免疫反应，并参与包括炎症调节、免疫稳态和组织修复在内的多种病理过程。与可溶性细胞因子不同，外泌体可同时转运多种功能分子，实现对靶细胞的协同调节，从而产生更持续和全面的免疫调节效应。
外泌体携带的分子货物在炎症性疾病进程中动态变化，这使供体细胞能够精细调控邻近和远端的靶细胞。免疫细胞来源的外泌体已被证实可调节炎症细胞募集和细胞因子产生；内皮细胞来源的外泌体参与内皮屏障功能；而间充质干细胞来源的外泌体主要具有抗炎、抗凋亡和组织修复作用。所有这些不同群体的外泌体构成了细胞间极其复杂的通讯网络，该网络不仅调节免疫系统，还修复组织并维持生理稳态。
在外泌体影响的众多靶细胞中，巨噬细胞已成为外泌体诱导免疫重塑的核心介质。凭借其显著的表型可塑性，巨噬细胞可快速响应外泌体来源的分子信号，动态改变其极化状态。因此，外泌体介导的巨噬细胞极化深刻影响炎症细胞因子产生、免疫细胞募集、组织再生和程序性细胞死亡，使巨噬细胞成为连接SI-ALI期间细胞间通讯与免疫重塑的关键调控枢纽。
近期研究还表明，外泌体的生物活性并非仅由单一货物决定，而是由多种生物活性分子协同作用所致。外泌体中的多种分子，包括RNA、蛋白质、DNA和脂质，共同参与M1和M2极化的精确调控。它们协同作用于SIRT1/SOCS1、NF-κB、PI3K/Akt、STAT3和NLRP3炎症小体通路等重要信号通路。这些信号网络由外泌体的多种组分协同调控，调节炎症的启动和消退、肺泡-毛细血管屏障的修复和肺组织再生。所有这些因素最终影响脓毒症所致ALI的病程。（图2）
综上所述，外泌体的免疫调节功能源于多种生物活性货物的协同作用，而非单一分子。因此，阐明外泌体中不同货物如何协同调控巨噬细胞极化，对于理解脓毒症诱导ALI的免疫病理机制和推进基于外泌体的精准治疗至关重要。
4. EVs调控巨噬细胞极化的机制
在脓毒症相关急性肺损伤中，EVs通过递送各种功能性组分参与巨噬细胞功能重塑，并调控炎症反应和组织修复过程。因此，本节首先分析外泌体不同组分调控巨噬细胞极化的分子机制，随后讨论微囊泡和凋亡小体在巨噬细胞免疫调节中的作用，以及EV介导的巨噬细胞功能重塑，以确定脓毒症相关ALI的潜在治疗靶点。
4.1. 外泌体中不同货物调控巨噬细胞极化的机制
4.1.1. 外泌体中的RNA调控巨噬细胞极化
miRNAs是外泌体中研究最广泛的功能性货物之一，通过在受体细胞中转录后水平调控基因表达，在细胞间通讯中发挥关键作用。在肺微环境中，参与调控巨噬细胞功能的外泌体miRNAs可来源于多种细胞，包括肺上皮细胞、免疫和免疫调节细胞以及间充质干/基质细胞。在脓毒症诱导的ALI期间，不同细胞类型释放的外泌体将特异性miRNAs递送至巨噬细胞，通过炎症信号通路调控巨噬细胞极化，重塑肺免疫微环境。
多种外泌体中的促炎miRNAs已被鉴定为M1巨噬细胞极化的有效诱导剂。其中，中性粒细胞来源外泌体中的miR-30d-5p是研究最深入的范例之一。被巨噬细胞摄取后，miR-30d-5p直接抑制SOCS1和SIRT1，导致NF-κB信号通路持续激活。除促进M1极化外，miR-30d-5p还诱导巨噬细胞焦亡（pyroptosis），从而增强IL-1β和IL-18等促炎细胞因子的释放。这些事件放大炎症级联反应，加剧肺泡-毛细血管屏障破坏，最终加重ALI。
除miR-30d-5p外，外泌体中的其他miRNAs也参与促炎性巨噬细胞极化。例如，外泌体miR-92a-3p通过NF-κB信号通路促进M1极化，与炎症介质产生增加和肺炎症加重相关。此外，免疫细胞来源外泌体递送的其他促炎miRNAs已被证实可维持NF-κB激活并增强炎症反应，从而加速疾病进展。
总体而言，尽管这些促炎miRNAs靶向不同的下游分子，但最终汇聚于以NF-κB为中心的炎症信号网络，促进M1巨噬细胞极化、炎症放大和肺损伤。这些结果表明，干扰外泌体中的致病性miRNAs或其下游信号可能是一种有前景的治疗策略，可抑制过度炎症并减轻脓毒症所致ALI。
除促炎miRNAs外，越来越多的证据表明，多种其他外泌体miRNAs可诱导巨噬细胞M2极化，有助于防止脓毒症相关ALI中的过度炎症反应并促进组织重塑。研究最广泛的治疗性外泌体群体之一是来源于间充质干细胞（MSCs）的外泌体。其诱导M2巨噬细胞极化，减少TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子的产生，同时增加IL-10等抗炎介质的分泌。所有这些效应累积性地降低肺部炎症并改善肺功能。MSC来源外泌体还递送miR-150-5p，通过靶向调控Irs1促进M2极化，从而抑制炎症反应并减轻肺泡损伤。同样，miR-184-3p通过调控Sema7a介导的信号传导促进M2巨噬细胞极化，有助于恢复肺泡-毛细血管屏障完整性并加速肺组织修复。
除MSC来源外泌体外，其他细胞类型释放的外泌体也表现出抗炎特性。来源于免疫细胞或组织驻留细胞的外泌体中的miRNAs通过STAT3和PI3K/Akt等信号通路促进M2极化，同时抑制与M1极化相关的炎症，从而促进炎症消退和组织再生。重要的是，新出现的证据表明，M2巨噬细胞不仅抑制过度炎症，还促进成纤维细胞调节、肺泡上皮再生、肺泡-毛细血管屏障完整性恢复和局部免疫微环境重建。因此，以增强M2巨噬细胞极化为目标的治疗策略在脓毒症诱导ALI的治疗中日益受到关注。
总体而言，尽管外泌体中的单个miRNAs靶向不同的下游分子，但它们汇聚于PI3K/Akt、IRS1和STAT3等信号通路，促进M2巨噬细胞极化，协同介导抗炎反应、组织修复和肺泡-毛细血管屏障功能恢复。这些调节性miRNAs与导致M1极化的促炎miRNAs共同构成动态的外泌体介导的巨噬细胞极化网络，参与脓毒症诱导ALI过程中的免疫重塑。总之，这些结果为开发基于外泌体的miRNA疗法以实现肺部炎症精准干预提供了额外支持。
除miRNAs外，外泌体还包含多种类型的非编码RNA，如lncRNAs和circRNAs。尽管这些RNA均不翻译为蛋白质，但它们通过转录调控、竞争性内源RNA（ceRNA）网络和细胞内信号通路对基因表达产生巨大的调控影响。因此，它们已成为炎症反应、免疫稳态和组织修复的重要调节因子。
近年来，外泌体中的lncRNAs作为巨噬细胞极化的关键调节因子日益受到关注。与主要直接抑制靶基因表达的miRNAs不同，lncRNAs通常通过充当ceRNAs或调节炎症信号通路来调控巨噬细胞表型。外泌体中的lncRNAs被递送至受体巨噬细胞后，调节NF-κB、STAT3和PI3K/Akt等信号通路，从而影响M1和M2极化之间的平衡，促进脓毒症诱导ALI的进展。其中，TUG1通过竞争性结合促炎miRNAs来调节下游炎症信号通路，从而驱动巨噬细胞向M2表型极化，降低TNF-α和IL-1β等促炎因子的表达，同时升高IL-10等抗炎介质的分泌，最终减轻肺部炎症并促进组织修复。
其他lncRNAs，如Gm16023和lncRNA-Cox2，也被证实参与巨噬细胞极化调控。这些分子控制炎症信号通路和免疫相关基因表达，从而抑制M1极化或增强M2极化，以减轻脓毒症诱导ALI中的炎症损伤。
总体而言，外泌体中不同类别的非编码RNA协同作用而非独立运作，建立了调控巨噬细胞极化的多层调控网络。这些协调的RNA网络共同调节炎症稳态、肺泡-毛细血管屏障修复和组织再生。因此，外泌体中的非编码RNA可作为治疗脓毒症诱导ALI的潜在靶点。
4.1.2. 外泌体中的蛋白质调控巨噬细胞极化
外泌体RNA主要控制基因的转录后表达，而外泌体蛋白质是直接的信号效应分子，可快速改变受体细胞的反应。越来越多的证据表明，外泌体中所含的蛋白质可直接刺激或抑制炎症信号通路，从而控制脓毒症诱导ALI中的巨噬细胞极化、炎症反应、组织修复和肺泡-毛细血管屏障稳态。
在目前已鉴定的促炎蛋白中，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是特征最明确的介质之一。外泌体中的HMGB1与TLR4和晚期糖基化终末产物受体（RAGE）相互作用，维持NF-κB激活，从而促进M1巨噬细胞极化，诱导TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子的大量产生。这些事件放大炎症级联反应，加剧肺上皮和内皮损伤。此外，活化炎症细胞释放的外泌体还转运其他促炎蛋白，进一步增强炎症信号传导并加速疾病进展。
相反，间充质干细胞（MSC）来源外泌体所递送蛋白质的保护作用日益受到关注。其中，热休克蛋白B8（HSPB8）已成为代表性的抗炎介质。外泌体递送HSPB8可抑制过度炎症反应，促进M2巨噬细胞极化，减轻组织病理学肺损伤。同样，CXCL14等蛋白质通过促进M2极化和增强ALI期间的组织修复参与免疫重塑。
总体而言，尽管不同外泌体蛋白的分子特性各异，但它们最终都影响炎症信号通路，从而控制巨噬细胞极化。促炎蛋白主要促进M1极化和炎症放大，而保护性蛋白则促进M2极化、组织再生和肺泡-毛细血管屏障完整性恢复。因此，外泌体蛋白在脓毒症所致ALI的调控中可能作为重要载体发挥作用。
4.1.3. 外泌体中的脂质调控巨噬细胞极化
除RNA和蛋白质外，脂质是外泌体中另一类重要的生物活性货物。尽管外泌体中的脂质最初被认为是主要维持膜完整性和介导膜融合的结构性货物，但越来越多的证据表明，它们也充当介导细胞间通讯的生物活性信号分子。外泌体中的脂质通过调节炎症信号、细胞代谢和免疫反应，已成为脓毒症诱导ALI中巨噬细胞极化的重要调节因子。
在外泌体中发现脂质种类中，1-磷酸鞘氨醇（S1P）、鞘氨醇和神经酰胺（ceramide）研究最为深入。S1P作为一种强效生物活性脂质介质，通过与S1P受体相互作用触发下游信号通路，如PI3K/Akt和STAT3。因此，S1P促进M2巨噬细胞极化，抑制促炎细胞因子的过度产生，改善肺泡上皮修复，并有助于恢复肺泡-毛细血管屏障完整性。鞘氨醇除参与外泌体生物发生外，还具有多种调节功能。持续的炎症激活与鞘脂代谢失调有关，恢复鞘氨醇稳态可抑制炎症损伤并促进组织修复。同样，神经酰胺作为外泌体生物发生中的主要结构脂质，也在炎症信号传导和细胞命运控制中发挥作用。神经酰胺的过度累积与ALI中炎症反应和组织损伤增加相关。
值得注意的是，外泌体中的脂质不仅作为递送至受体细胞的信号货物，还调节外泌体的生物合成、货物装载、膜融合和细胞摄取。因此，脂质代谢同时影响外泌体的数量和生物活性，提示靶向脂质的干预措施可能同时调节外泌体产生和免疫调节能力。总之，多种脂质分子通过协同调节炎症信号、免疫代谢和细胞膜稳态，参与巨噬细胞表型转换、肺泡-毛细血管屏障修复和组织再生。
4.1.4. 外泌体中的DNA调控巨噬细胞极化
除RNA、蛋白质和脂质外，DNA也是外泌体中可检测到的关键功能组分之一。近期研究表明，外泌体可携带基因组DNA（gDNA）和线粒体DNA（mtDNA），通过介导核酸信息转移参与受体细胞免疫功能的调节。
在脓毒症相关ALI的炎症微环境中，感染性刺激、氧化应激和线粒体损伤可促进受损细胞释放富含mtDNA的EVs。进入巨噬细胞后，外源性mtDNA被TLR9和cGAS-STING等DNA感知通路识别为损伤相关分子模式，激活NF-κB转录程序和NLRP3炎症小体信号传导，促进IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的释放，从而增强巨噬细胞的炎症活化。例如，氧化型mtDNA可直接促进NLRP3炎症小体活化并诱导IL-1β成熟，表明mtDNA是连接线粒体损伤与炎症反应的关键内源性信号分子。此外，线粒体DNA的释放可激活cGAS-STING介导的先天免疫反应，促进炎症相关基因的表达。因此，在SI-ALI中，富含mtDNA的外泌体可能增强巨噬细胞的先天免疫识别，促进促炎表型的维持，并参与炎症反应的放大。
然而，EV-DNA的生物学效应取决于多种因素的复杂相互作用，如DNA的来源、外泌体组成和疾病分期。相对而言，DNA主要作为免疫危险信号，通过刺激特定感知通路改变巨噬细胞的炎症状态。因此，外泌体中的DNA通常是连接细胞损伤信号与免疫反应的调控因子，而非巨噬细胞极化的直接驱动因素。
4.1.5. 外泌体多组分协同调控巨噬细胞极化的机制
尽管外泌体中的RNA、蛋白质、DNA和脂质可独立调控巨噬细胞极化，但这些不同的生物活性组分并非孤立作用。相反，它们通过多层次、多维度的调控网络共同决定巨噬细胞命运和脓毒症诱导ALI的进展。（图3）
在分子调控层面，外泌体中的不同货物通过互补机制调控受体巨噬细胞。miRNAs主要在转录后水平抑制靶基因表达，而lncRNAs和circRNAs通过ceRNA网络调节基因表达。外泌体中的蛋白质可通过配体-受体相互作用、蛋白质转移或细胞内信号传导发挥作用。外泌体中的脂质不仅充当生物活性信号分子，还有助于维持外泌体的膜结构并影响囊泡与受体细胞的相互作用。与上述组分不同，外泌体中的DNA主要作为损伤相关信号，通过TLR9和cGAS-STING等DNA感知通路参与先天免疫反应的激活。由此可见，不同组分在结合位点和调控模式上并不相同，这也是它们在受体巨噬细胞中表现出不同功能效力的原因。
在调控网络层面，不同类别非编码RNA之间的相互作用建立了多层调控网络。通过ceRNA介导的相互作用，miRNAs、lncRNAs和circRNAs协同调控炎症基因表达，实现对免疫反应的动态和情境依赖性调节。这种网络组织形式增强了外泌体介导信号传导的强度和精确性。
在时空动态层面，外泌体所携带货物的生物活性随疾病进展而变化。当肺微环境中炎症信号和组织损伤信号占优势时，促炎RNA、炎症相关蛋白或mtDNA可能表现出更强的免疫刺激效应。当免疫调节和组织修复相关信号增加时，具有抗炎或代谢调节作用的组分可能发挥更强的功能效应。然而，这种转变并不意味着SI-ALI简单地处于促炎与免疫抑制或修复状态之间的线性转换。
总体而言，外泌体调节的巨噬细胞极化状态不能归因于单一分子介质或特定信号转导途径。相反，这种表型由包装在外泌体中的多种生物活性成分（即RNA、多肽和脂质部分）的协同生物学作用决定。这些货物通过协调的分子调控、信号串扰和细胞间通讯共同调节炎症反应和组织修复。更深入地理解这些复杂调控网络可能为脓毒症诱导ALI的发病机制提供新见解，并促进靶向外泌体介导免疫调节的新型治疗策略的开发。
4.1.6. 不同脓毒症微环境中外泌体内各货物的优先级
现有研究表明，在活菌感染条件下，受感染巨噬细胞来源的外泌体可诱导未感染巨噬细胞产生炎症反应。蛋白酶K（Proteinase K）处理可显著减弱该效应，而RNase或DNase处理则无类似影响。这表明蛋白质在此类条件下是主要的促炎效应组分。在脓毒症进展过程中，LPS和CLP刺激可增加巨噬细胞来源外泌体中eCIRP的水平。与含eCIRP的外泌体相比，缺乏eCIRP的外泌体诱导巨噬细胞产生TNF-α和IL-6的能力显著降低。这表明该蛋白是介导外泌体促炎效应的重要功能组分。
相反，组分耗竭实验揭示，EVs中蛋白质和RNA的作用取决于受体巨噬细胞的状态。在LPS未刺激的巨噬细胞中，外泌体蛋白主要促进炎症激活。而在LPS刺激的巨噬细胞中，RNA主要在限制过度炎症反应方面发挥作用。Zheng等人的实验也验证了这一观点。他们发现，在LPS刺激的巨噬细胞中，经LPS预处理的MSC来源外泌体主要通过RNA发挥保护作用。RNase处理后该保护作用显著降低，而蛋白酶K处理影响甚微。总体而言，在病原体感染条件下，外泌体中的蛋白质在诱导巨噬细胞炎症激活中起关键作用。然而，当受体巨噬细胞已处于LPS诱导的炎症状态时，特定RNA将限制或调节过度炎症反应。这些观察结果表明，RNA和蛋白质介导的调节功能的相对优先级取决于供体细胞及其受体巨噬细胞的状态。
因此，脓毒症微环境在定义外泌体中货物的相对功能作用方面起着至关重要的作用。这种效应主要通过两种形式实现：一是改变供体细胞中各种货物的相对浓度，二是改变受体巨噬细胞的反应状态。
首先，脓毒症微环境可能通过改变供体细胞的状态来影响外泌体组分的装载。外泌体中的这些货物并非供体细胞内容物的简单复制；它们随细胞环境的变化而在组成和浓度上动态变化。例如，缺氧可能通过HIF、Rab蛋白和氧化应激介导的过程影响外泌体生物发生和不同组分的装载，并可能改变EVs中的miRNA表达谱。其中，miR-23a、miR-21和miR-223均表现出环境变异性。脓毒症休克患者的血浆外泌体与健康对照相比具有不同的RNA谱。治疗7天后，多种miRNAs仍保持改变，髓过氧化物酶（MPO）mRNA仍升高。这些发现表明，脓毒症期间的炎症和氧化应激可能对外泌体RNA货物产生持续影响。此外，炎症刺激也可重塑外泌体的蛋白质组成。研究表明，LPS刺激后，巨噬细胞来源外泌体中341种蛋白质增加，363种蛋白质减少。此外，细胞应激也可影响外泌体中的线粒体相关组分；抗霉素A诱导的线粒体氧化应激显著增加外泌体中的mtDNA含量。通过比较不同刺激条件下的巨噬细胞来源外泌体，研究发现蛋白质和小非编码RNA的组成存在显著差异。这些结果表明，即使来源于相同细胞类型，在不同炎症和代谢条件下产生的外泌体，其RNA、蛋白质和其他组分的水平也会有所不同。这些变化将影响RNA、蛋白质、脂质和DNA参与受体细胞调控的潜力。
然而，外泌体组分的浓度并不直接反映其功能贡献。目前，大多数研究对大量EVs进行批量分析，所得结果反映的是EV群体的平均组成，不能充分捕捉单个EV所携带的特定组分。目前的研究表明，某种miRNA并非存在于所有外泌体中，不同外泌体所携带RNA的种类和数量也存在显著差异。因此，仅凭外泌体中各组分的浓度难以有效判断哪种货物发挥主要作用。
另一方面，外泌体中的组分能否产生强功能效应还取决于受体巨噬细胞的反应状态。脓毒症中的PAMPs、DAMPs和细胞因子可重塑巨噬细胞的受体表达、代谢途径和细胞内信号传导活性。因此，即使由具有相似货物的外泌体介导，不同状态的巨噬细胞也可能引发不同的反应。
外泌体中的RNA通常必须先被受体细胞摄取，经历细胞内转运和货物释放，然后到达适当的亚细胞位置才能发挥其调节作用。其效应不仅取决于有效递送的量，还受靶RNA丰度和相关信号网络状态的影响。当特定RNA被有效递送至靶细胞时，RNA组分的功能贡献就会增强。这解释了上述研究中LPS刺激后RNA组分效应显著增强的原因。
蛋白质组分的功能受其拓扑位置和受体表达状态的影响。位于外泌体表面的某些蛋白质可直接与巨噬细胞膜受体结合，无需释放细胞内组分即可启动下游信号传导。因此，与依赖内吞作用、胞质释放和靶标识别的组分相比，这些表面蛋白可能具有更直接和更快速启动信号的优势。然而，更快的信号启动并不一定意味着这些蛋白质在最终功能效应中始终占主导地位。这是因为持续的巨噬细胞功能重塑可能仍受RNA和其他货物的共同调控。
类似的受体依赖机制也可能存在于DNA和脂质货物中。外泌体DNA的效应取决于TLR9和cGAS-STING等DNA感知通路的活性。在氧化应激或线粒体功能障碍加剧的条件下，如果表达受体的巨噬细胞也具有较高的DNA感知能力，则免疫刺激DNA的效应可能进一步放大。另一方面，脂质货物的效应与脂质受体和代谢途径密切相关。例如，细胞因子环境可改变巨噬细胞中脂质代谢相关分子的表达，如PPARγ和CD36，从而影响其对脂质信号的响应。因此，货物的功能贡献不仅取决于外泌体携带了什么，还取决于受体巨噬细胞是否处于能够响应这些组分的状态。
总之，外泌体组分（如RNA、蛋白质、脂质和DNA）对免疫调节效应的相对贡献并非固定不变，而是明显依赖于微环境。脓毒症微环境可改变这些组分的装载、相对丰度和分子修饰，也可重塑受体巨噬细胞的代谢状态和信号反应性，从而影响各组分的实际调节作用。（图4）
4.2. 微囊泡对巨噬细胞极化的调控
除外泌体外，MVs作为另一种重要的EV亚型也参与SI-ALI过程中免疫细胞的功能重塑。由于MVs直接来源于细胞膜出芽过程，其组成特征反映了供体细胞的激活状态，使其能够在炎症微环境中快速响应和传递信号。在SI-ALI期间，多种损伤相关细胞和免疫细胞可释放MVs
