《Cells》：Establishment of a 3D Co-Culture System Using OFT Cell Line and Effect of Hormone Supplementation on Germline Gene Expression in Olive Flounder (Paralichthys olivaceus)
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摘要：体外三维（3D）细胞培养系统提供了模拟天然组织架构的生理相关微环境。然而，在硬骨鱼类中建立功能性3D睾丸聚集体仍具挑战性。本研究中，研究人员通过整合已建立的牙鲆（Paralichthys olivaceus）睾丸细胞（OFT）系，为牙鲆原代睾丸细胞建立了
摘要：体外三维（3D）细胞培养系统提供了模拟天然组织架构的生理相关微环境。然而，在硬骨鱼类中建立功能性3D睾丸聚集体仍具挑战性。本研究中，研究人员通过整合已建立的牙鲆（Paralichthys olivaceus）睾丸细胞（OFT）系，为牙鲆原代睾丸细胞建立了一种新型3D共培养聚集体系统。单独培养的原代睾丸细胞在超低吸附板中24小时内未能形成3D聚集体。然而，与OFT细胞共培养可在24小时内快速启动3D聚集体组装。此外，补充性激素与生长因子混合物可在无细胞毒性效应的情况下维持高细胞活力。值得注意的是，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析显示，激素与生长因子补充显著上调了plzf（2.15倍）和scp3（2.34倍）的转录水平。这些结果表明，OFT细胞系对于促进原代睾丸细胞组装并整合入3D聚集体至关重要，而性激素与生长因子则促进聚集体内精原干细胞维持和减数分裂进程。总体而言，该3D共培养平台可作为鱼类精原干细胞研究和水产养殖生殖生物技术的有价值体外工具。
牙鲆（Paralichthys olivaceus）是东亚地区重要的水产养殖物种，然而其生殖干细胞的体外培养体系尚未建立。生殖系干细胞（GSCs）通过与体细胞的复杂相互作用将遗传信息传递至下一代，基于此开发的替代亲本技术在水产养殖中具有广阔前景，但供体GSCs数量有限制约了其应用。研究人员前期虽建立了牙鲆睾丸体细胞（OFT）系用于支持雄性GSCs培养，但传统二维（2D）培养系统无法长期维持精原干细胞（SSCs）。为模拟体内微环境并改进GSC支持效果，研究人员构建了3D共培养系统，将牙鲆原代睾丸细胞与已建立的OFT细胞系共培养，诱导形成3D睾丸聚集体，并评估性激素与生长因子对聚集体形态、细胞活力及生殖系标记基因表达的影响。该研究旨在为牙鲆功能性体外GSC培养体系开发提供基础，并推动水产养殖物种生殖生物技术的发展。该研究成果发表于《Cells》。
研究人员开展了以下实验：将9条1龄非繁殖季节牙鲆（平均体重364.2±99.0克，平均全长30.1±2.6厘米）的睾丸组织（样本来源于韩国釜山国立渔业科学研究所，经IACUC批准）采集并合并为三个独立样本池，经酶消化获得原代睾丸细胞。将5×10?个原代细胞与5×10?个OFT细胞接种于超低吸附（ULA）96孔板中进行共培养，以单独原代细胞培养作为对照，并设置添加性激素（11-酮基睾酮、17β-雌二醇、17α,20β-双羟孕酮、人绒毛膜促性腺激素）和生长因子（表皮生长因子、胰岛素样生长因子1）的处理组，培养14天。主要关键技术方法包括：原代睾丸细胞分离技术、基于超低吸附板的3D共培养模型构建、Live/Dead细胞活力染色与台盼蓝染色评估细胞存活、以及通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测生殖系标记基因plzf和scp3的表达水平。
研究结果如下。
性激素、生长因子和OFT细胞对睾丸聚集体的影响：通过形态学观察发现，单独培养的原代睾丸细胞（无论是否添加激素与生长因子）在24小时内均未形成聚集体；而共培养体系中，OFT细胞显著促进并加速了3D聚集体的组装，在培养第1天即形成多个细胞簇，并在14天培养期内逐渐融合为单个致密的球形聚集体。该结果表明OFT细胞系对牙鲆原代睾丸细胞的3D聚集体形成具有关键的支架和驱动作用。
性激素和生长因子对3D聚集体细胞活力的影响：通过Live/Dead染色和台盼蓝染色分析，发现添加激素与生长因子的共培养聚集体（93.0±1.65%存活率）与未添加组（91.0±0.4%存活率）均保持高细胞活力，两组间无统计学显著差异。该结果表明性激素和生长因子补充对3D共培养聚集体的细胞活力无不利影响。
性激素和生长因子对生殖系标记基因表达的影响：通过qRT-PCR检测发现，与未添加激素和生长因子的对照组相比，添加组中精原干细胞标记基因plzf的表达显著上调2.15±0.69倍，减数分裂生殖细胞标记基因scp3的表达显著上调2.34±0.79倍。该结果表明性激素和生长因子补充在3D共培养聚集体中同时促进了精原干细胞的维持和减数分裂进程。
在讨论部分，研究人员指出OFT细胞系作为体细胞支持层对聚集体形成的必要性具有物种特异性，并回顾了哺乳动物研究中睾丸支持细胞在类器官组装中的关键作用。激素混合物中不同成分可能分别发挥促增殖（如E2、hCG、IGF-1、EGF）和促减数分裂（如11-KT、DHP）的功能，但各因子单独作用及协同效应仍需进一步系统评估。研究也承认该实验存在局限性，包括未对聚集体内生殖细胞比例和空间分布进行组织学验证，且全聚集体qRT-PCR分析可能反映的是生殖细胞相对比例变化而非单细胞转录活性变化。尽管如此，该3D共培养平台展示了硬骨鱼类中体细胞-生殖细胞相互作用的进化保守性，为水产养殖生殖生物技术及生殖细胞保存提供了基础工具。
研究结论：本研究利用已建立的OFT细胞系，成功建立了一种新型3D共培养聚集体系统，用于牙鲆原代睾丸细胞培养。结果表明，仅原代睾丸细胞无法自组装，而与OFT细胞共培养在促进和加速3D睾丸聚集体形成及介导生殖细胞整合方面发挥关键作用。此外，补充性激素（11-KT、DHP、E2、hCG）和生长因子（EGF、IGF-1）混合物在维持高细胞活力的同时，显著上调了精原干细胞标记物plzf和减数分裂生殖细胞标记物scp3的转录水平。总体而言，该3D共培养平台为维持、增殖和分化硬骨鱼类生殖系干细胞提供了有价值的体外模型，可作为水产养殖先进生殖生物技术和生殖细胞保存的基础工具。
