草青贮饲料的微生物状况与农业实践的关系：一项为期四年的研究

《Foods》：Microbiological Status of Grass Silages in Relation to Agricultural Practices: A Four-Year Study

　　

青贮饲料作为牛饲料的基本组成部分，其微生物质量对动物健康和人类安全均至关重要。这项长期研究评估了从波兰养牛场采集的草青贮饲料的微生物状况，旨在评估人畜共患病原体的流行率及卫生指标与青贮前和青贮过程中农业实践的关系。研究人员共在全国范围内由兽医官员从各市镇随机采集了160份草青贮饲料样品。研究人员测定了pH值，并分析了包括李斯特菌属（Listeria spp.）、梭菌属（Clostridium spp.）、沙门氏菌属（Salmonella spp.）、大肠杆菌（Escherichia coli）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）在内的病原体的存在情况及载量。仅17.5%的草青贮饲料处于最佳目标pH范围内。相反，80.6%的样品超过了参考上限，表明普遍存在发酵不良和青贮质量低下的问题。在5.6%的饲料中检出李斯特菌属，且仅出现在pH值不合格的青贮饲料中。梭菌属高度流行，在所有样品中82.5%检测呈阳性，而产气荚膜梭菌（C. perfringens，主要为A毒素型）在26.2%的样品中被鉴定。沙门氏菌属和产肉毒神经毒素梭菌分别在单独的单个样品中检出，两者的pH值均较高。此外，在10.6%的受检青贮饲料中，真菌计数达到超过6 log₁₀ cfu/g的高水平，不适合饲喂。26.2%的农户采用青贮接种，显著降低了pH值并减少了腐败微生物的数量。此外，接种青贮饲料达到正确pH值的可能性是未接种饲料的三倍以上。相比之下，有机施肥与梭菌属和蜡样芽孢杆菌的平均计数增加相关。总之，草青贮饲料极易发生发酵不良和微生物污染。

论文解读：草青贮饲料微生物状况与农业实践的关系

**一、研究背景与目的**

粗饲料约占反刍动物日粮的三分之二至四分之三，其中草青贮饲料（grass silage, GS）是全球范围内仅次于玉米青贮饲料（maize silage, MS）的最常见粗饲料，在波兰牛营养中占据重要地位。草青贮饲料由幼嫩牧草经发酵保存制成，相较于玉米青贮饲料，具有更高的蛋白质和抗氧化剂含量。优质草青贮饲料的特征包括高营养价值、有氧稳定性、低pH值、优异的采食潜力和微生物安全性。然而，尽管关于草青贮饲料营养价值的数据丰富，但对其微生物质量的信息仍然有限。现成饲喂青贮饲料的微生物载量受植株上附生微生物区系组成、青贮过程中的二次污染以及储存和饲喂期间条件的影响。

从食物链卫生的角度来看，草青贮饲料可能成为土传微生物的来源或载体，特别是在pH值未充分降低或存在氧气的情况下。某些病原体，如李斯特菌属、梭菌属和芽孢杆菌属成员，肠杆菌科细菌以及产毒真菌，对动物健康和牛源食品安全构成显著危害。青贮饲料的高水分活度、缓冲能力和水溶性碳水化合物的存在有利于微生物增殖。乳酸菌发酵产生的厌氧条件和发酵终产物可降低最终pH值并抑制不良微生物。然而，如果青贮过程进行不当，腐败或致病微生物可能增殖，使草青贮饲料具有微生物学危害。此外，使动物接触高微生物载量的饲料会刺激免疫系统，引发促炎细胞因子和干扰素的产生，启动急性期反应，导致发热、食欲不振和肌肉氨基酸重吸收，营养分配从肉和奶生产转向肝脏急性期蛋白和瘦素的合成，从而降低动物生产力和盈利能力。为确保动物和人类安全，欧洲根据第2003/99/EC号指令在食物链各相关阶段监测人畜共患病原体。鉴于上述考虑，本研究旨在评估来自养牛场的草青贮饲料的微生物状况，特别评估人畜共患病原体的流行率与青贮前和青贮过程中因素（如农场特征、草地耕作实践和青贮过程）的关系，并假设特定农业实践显著影响草青贮饲料的卫生质量。

**二、研究设计与方法**

研究人员于2014年至2017年间从波兰养牛场随机采集了共160份草青贮饲料样品，由兽医官员在全国各市镇进行随机抽样。使用草芯采样器从草捆核心取样，严格保持无菌技术以防止二次污染。样品在冰上运输至普瓦维国家兽医研究所（NVRI），并在-20°C下保存至多7天，分析前在2–8°C下解冻至少24小时。每份青贮饲料均附有一份详细问卷，涵盖农场特征、草地耕作实践和青贮程序，包括牛群规模、农户青贮经验、土壤质量、除草剂或有机肥料施用情况、青贮接种剂使用、青贮成熟度以及人畜共患病病史。

研究方法主要包括以下关键技术：（1）pH值测量：将100 g草青贮饲料与100 mL双蒸馏水混合均质，使用pH计测定发酵质量，参考范围为3.8至4.4。（2）微生物分析：采用定性标准培养方法检测沙门氏菌属、梭菌属、单核细胞增生李斯特菌和弯曲杆菌属的存在；采用定量标准培养方法估算总平板计数（TPC）、需氧嗜温菌（AMB）、真菌、厌氧产芽孢菌（ASFB）、肠杆菌科、大肠杆菌、推定蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、嗜温乳酸菌（LAB）和凝固酶阳性葡萄球菌（CoPS）的数量。（3）梭菌分离株PCR分型：对分离的产气荚膜梭菌进行多重聚合酶链反应（mPCR）毒素分型，检测cpa、cpb、cpb2、etx、iap和cpe毒素基因；疑似产肉毒神经毒素（BoNT）梭菌通过实时PCR方法确认，检测ntnh基因。（4）MALDI-TOF MS鉴定：使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定其他可疑细菌。统计学分析采用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性，非参数Mann–Whitney U检验用于比较，χ2检验分析定性参数，Kruskal–Wallis检验进行多年比较，Spearman秩相关系数评估变量间关联。

**三、研究结果**

**3.1 农场特征**

研究包括来自规模5至1693头动物的农场的草青贮饲料样品。农户的青贮经验从1年到约60年不等。青绿饲料采自覆盖土壤质量等级I–VI的草地。44.4%的农场施用有机肥料，主要使用粪肥或泥浆（43.1%）和家禽垫料（1.2%）。13.1%的农场报告使用除草剂。26.2%的草青贮饲料使用了接种剂。青贮成熟度约为1至16个月。所有农户报告其草青贮饲料批次安全，采样前未观察到因青贮质量差导致的临床疾病症状。然而，调查数据显示一个养牛场有李斯特菌病病史（0.6%），另一个有肉毒中毒病史（0.6%）。

**3.2 草青贮饲料的pH值**

青贮饲料的pH值范围为3.2至6.8。仅17.5%的样品在目标范围内，82.5%超出最佳范围。具体而言，1.9%低于参考下限，80.6%超过上限。3.7%的草青贮饲料pH值低于4，35.6%在4至5之间，60.6%高于5。

**3.3 细菌流行率**

在5.6%的受检饲料中检出李斯特菌属。pH值最佳的样品未检出这些细菌，而在pH值不合格的青贮饲料中，6.8%检出李斯特菌属。单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌各占2.5%，斯氏李斯特菌占0.6%。82.5%的样品梭菌属检测呈阳性。产气荚膜梭菌在26.2%的样品中被鉴定。产BoNT梭菌在单个青贮饲料样品中检出（0.6%），pH值为5.4。沙门氏菌在单个样品中检出（0.6%），pH值为6.4。所有受检草青贮饲料样品均未检出弯曲杆菌属。肠杆菌科、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的总流行率分别为10.6%、5.6%和50.6%。凝固酶阳性葡萄球菌未检出。

**3.4 梭菌分离株的毒素型**

在42株产气荚膜梭菌分离株中，毒素型A占95.2%，D占2.4%，E占2.4%。pH值正确的青贮饲料分离株均为A型，而pH值不正确的青贮饲料分离株中A型占94.6%，D型占2.7%，E型占2.7%。45.2%的总产气荚膜梭菌分离株携带cpb2基因。分离的产BoNT梭菌菌株被鉴定为B型肉毒梭菌（C. botulinum type B）。

**3.5 卫生指标计数**

pH值正确的草青贮饲料中，TPC和AMB平均计数相似。真菌污染偏向范围下限，67.8%的饲料真菌计数限制在1 log₁₀ cfu/g。LAB计数分布范围广，50%的样品维持高种群。pH值不正确的青贮饲料表现出更高的微生物负担，平均值增加多达1 log₁₀ cfu/g，微生物范围上限达5.3 log₁₀ cfu/g。定性检验显示，pH值正确的草青贮饲料与接种（p = 0.0016）和除草剂施用（p = 0.0077）显著相关。定量分析显示，pH值正确的青贮饲料在AMB（p = 0.0257）、真菌（p = 0.0145）、LAB（p = 0.0300）和肠杆菌科（p = 0.0461）计数以及牛群规模（p = 0.0107）和青贮经验（p = 0.000047）方面存在显著差异。年度间比较显示，2014年和2017年间真菌计数（p = 0.0282）和LAB计数（p = 0.0365）存在显著差异，蜡样芽孢杆菌污染在2014年与2016年间（p < 0.0001）以及2016年与2017年间（p = 0.0018）存在显著差异。

**3.6 有机施肥的影响**

有机施肥的牧草产生的青贮饲料pH值范围为3.20至6.82，未施肥的为3.60至6.80。有机施肥的青贮饲料中，细菌流行率为：李斯特菌属4.2%，ASFB 84.0%，产气荚膜梭菌31.0%，肠杆菌科4.2%，大肠杆菌2.8%，蜡样芽孢杆菌52.1%。未施肥的青贮饲料中这些参数分别为6.7%、80.9%、22.5%、15.7%、7.9%和49.4%。有机施肥与AMB、梭菌属和蜡样芽孢杆菌的平均计数增加相关。草青贮饲料在肠杆菌科计数（p = 0.0237）和牛群规模（p = 0.0192）方面表现出显著差异。

**3.7 青贮接种的影响**

接种的青贮饲料pH值范围为3.20至6.30，未接种的为3.36至6.82。接种的青贮饲料中78.6%梭菌属阳性，9.5%肠杆菌科阳性，0.5%大肠杆菌阳性；未接种饲料的流行率分别为83.9%、11.0%和5.9%。接种的青贮饲料在TPC、AMB、真菌、LAB和ASFB方面表现出更低的平均值和中位数。接种与达到正确青贮pH值的几率增加三倍以上相关（OR = 3.71；95% CI: 1.59–8.69）。

**3.8 参数相关性**

较大牛群的拥有者和更有青贮经验者更频繁使用接种剂。接种与真菌计数呈负相关。牛群规模、青贮经验、青贮接种、除草剂施用和年平均降雨量均与草青贮饲料的pH值呈负相关。pH值与TPC、AMB计数、真菌计数、肠杆菌科和李斯特菌属流行率呈正相关。蜡样芽孢杆菌的流行率与除草剂施用、年平均温度、TPC、AMB计数和LAB计数呈弱负相关。年平均温度与年平均降雨量之间呈强负相关。较低的年平均降雨量对应较低的真菌计数。较高的年平均温度与TPC、真菌和LAB计数增加相关。TPC与AMB、真菌、LAB、肠杆菌科、大肠杆菌和梭菌计数以及李斯特菌属检出之间存在强或中度正相关。李斯特菌属的存在受较高pH值和TPC、AMB、真菌、LAB、肠杆菌科和大肠杆菌水平升高的促进。

**四、讨论与结论**

本研究发现极高比例的草青贮饲料样品pH值不合格，表明发酵不良和青贮质量低下，导致有氧不稳定性和二次微生物生长。与玉米青贮饲料相比，草青贮饲料的梭菌属和产气荚膜梭菌流行率更高，这与其较低的割草高度、较大的土壤污染和较慢的酸化有关。产气荚膜梭菌毒素型A占绝对优势，但pH值不合格的青贮饲料中检测到D型和E型，以及更高比例的β2毒素基因阳性菌株，表明不良青贮条件可能选择性促进β2产毒菌株的生长。李斯特菌属仅在pH值不合格的青贮饲料中检出，且与pH值呈正相关。有机施肥与梭菌属和蜡样芽孢杆菌计数增加相关，而青贮接种可显著降低pH值并减少腐败微生物，使达到正确pH值的几率增加三倍以上。研究还发现10.6%的青贮饲料真菌计数超过6 log₁₀ cfu/g，不适合饲喂。

研究结论指出，饲料是牛生产中最主要的经济投入之一，也是牛群健康和生产盈利的关键决定因素。虽然青贮饲料是现代奶牛和肉牛日粮的基石，但其质量评估常常未考虑病原微生物。然而，不合格或受污染的青贮饲料可能携带损害动物性能、诱发牛病并对人类健康构成重大威胁的病原体。本研究证实草青贮饲料极易发生发酵不良和微生物污染。在正确发酵的草青贮饲料中，pH值在两周内降至抑制病原体的水平，这种保护性酸性在包装良好的草捆中可保持稳定长达三年。因此，实施良好生产规范和更广泛采用生物接种剂是确保饲料安全的关键步骤。维持3.4至4.3的pH范围内的严格厌氧条件可抑制兼性厌氧病原体的增殖，包括大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽孢杆菌。然而，pH 4.1的厌氧环境仍对丁酸梭菌活性敏感，而pH值高于4.5则促进产肉毒毒素梭菌的生长。