活动性结核病中与铁死亡相关基因集相交的免疫-炎症枢纽基因：一项多数据集生物信息学研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Immune–Inflammatory Hub Genes Intersecting with a Ferroptosis-Associated Gene Set in Active Tuberculosis: A Multi-Dataset Bioinformatics Study

　　

摘要翻译：结核病（tuberculosis, TB）从潜伏感染进展为活动性疾病涉及宿主免疫、炎症、氧化和代谢通路的复杂修饰。铁死亡（ferroptosis）是一种需要铁且与过度脂质过氧化相关的独特调节性细胞死亡形式，并已被认为与TB中的组织损伤有关；然而，其与活动性TB期间宿主转录变化之间的联系尚未完全阐明。本研究旨在采用整合转录组学和系统生物学方法，在活动性TB差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）中鉴定与来源于FerrDb的铁死亡相关基因集相交的免疫-炎症枢纽基因，并进行外部验证。对GSE37250的差异表达分析显示，与潜伏性TB相比，活动性TB中有1015个DEGs，包括585个上调和430个下调基因；与健康对照相比，活动性TB中有93个DEGs，包括65个上调和28个下调基因。交集分析确定了94个活动性TB对比潜伏性TB比较与铁死亡相关基因集共有的DEGs，以及8个活动性TB对比健康对照比较与同一基因集共有的DEGs，且没有基因在所有三个集合中共享。对94个交集基因的功能富集强调了免疫应答、防御应答、应激应答、Toll样受体信号传导、NOD样受体信号传导、IL-17信号传导、TNF信号传导、谷胱甘肽代谢、中性粒细胞脱颗粒、细胞因子信号传导和抗菌金属隔离。蛋白质-蛋白质相互作用分析随后经cytoHubba优先级排序确定了10个枢纽基因：IL1B、TLR4、CXCL10、MMP9、CYBB、MPO、CD36、LCN2、S100A8和LTF。在与结局无关的探针选择之后，GSE28623中的外部验证显示LCN2、S100A8和LTF显著正向差异表达，而GSE62525显示IL1B、TLR4、MMP9、MPO、LCN2和LTF显著正向差异表达。LCN2和LTF在两个验证数据集中均显著上调，表明其具有最强的跨数据集可重复性。这些结果确定了活动性TB中与铁死亡相关基因相交的免疫-炎症转录网络。值得注意的是，转录组学发现并不证实铁死亡性细胞死亡，但为未来的实验探索提供了候选基因和生物学过程。

活动性结核病中与铁死亡相关基因集相交的免疫-炎症枢纽基因：一项多数据集生物信息学研究——论文解读

**1. 研究背景与立题依据**

结核病（tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（M. tuberculosis）引起的全球性重大传染病。尽管诊断和治疗方法不断进步，TB仍造成巨大的发病率和死亡率。世界卫生组织报告显示，2024年TB夺去了123万人的生命，其中包括15万HIV感染者，且TB仍是与抗菌药物耐药性相关的主要死亡原因之一。全球约有四分之一的人口感染了M. tuberculosis，但其中仅有一部分个体从潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection, LTBI）进展为活动性疾病，因此理解疾病进展的生物学决定因素具有重要临床意义。

从潜伏感染向活动性TB的转变受M. tuberculosis与宿主免疫系统之间复杂相互作用的影响。活动性TB与炎症反应紊乱、巨噬细胞活化、中性粒细胞募集、氧化应激以及损伤组织的免疫病理相关。全血转录组学研究已一致鉴定出活动性TB中与干扰素和中性粒细胞相关的特征，但这些特征仅能区分活动性疾病与LTBI及其他临床状况，连接免疫活化、氧化损伤、脂质失调和调节性细胞死亡的分子机制尚未明确。

铁死亡是一种铁依赖性、非凋亡性的调节性细胞死亡形式，由脂质过氧化和活性氧水平升高介导。铁死亡与TB的相关性在于，M. tuberculosis感染会破坏宿主铁稳态、诱导氧化应激，并导致巨噬细胞损伤和组织坏死。实验证据表明，铁死亡可能参与TB的发病机制。Amaral等人证明，感染M. tuberculosis的巨噬细胞中的细胞死亡依赖于铁介导的细胞脂质氧化损伤，且抑制铁死亡可减少细胞死亡和组织损伤。

然而，该领域存在显著的研究空白。以往大多数TB转录组学研究广泛聚焦于干扰素信号传导、免疫活化或一般性生物标志物发现，而将铁死亡相关基因与差异基因表达谱、通路和功能注释、蛋白质相互作用网络构建、枢纽基因选择及独立数据集评估相结合的研究较少。特别是铁死亡相关转录变化与关键免疫过程（如Toll样受体信号传导、中性粒细胞脱颗粒、活性氧产生、脂质失调、抗菌金属隔离和活动性TB中的组织重塑）之间的联系仍认识不足。因此，研究人员开展本研究，旨在通过整合生物信息学方法，鉴定并验证活动性TB中与铁死亡相关基因集相交的免疫-炎症枢纽基因。

**2. 研究技术方法概述**

研究人员从NCBI基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取公开的人类TB转录组数据集。发现数据集为GSE37250，采用GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 Expression BeadChip平台，包含PAXgene管采集的全血样本。外部验证使用GSE28623（全血基因表达谱）和GSE62525（台湾人群外周血单核细胞表达谱，比较活动性TB、LTBI和健康状态）。研究方法包括：使用GEO2R（基于R包GEOquery和limma）进行差异表达分析；从FerrDb V3获取铁死亡相关基因集并与差异表达基因取交集；使用g:Profiler/g:GOSt进行功能富集分析；使用STRING数据库v12.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络；使用Cytoscape软件3.10.3版本及cytoHubba插件（MCC和Degree两种算法）进行枢纽基因鉴定；在GSE28623和GSE62525中进行外部验证，每个基因多个探针时选取所有样本中平均标准化表达强度最高的探针（与结局无关的标准），以调整后p值<0.05和正logFC为统计验证标准。

**3. 研究结果**

**3.1 基因表达谱显示活动性TB具有独特的转录改变**

使用GSE37250，将活动性TB与LTBI及健康个体进行比较。以padj<0.05为统计学显著阈值。活动性TB对比LTBI显示比活动性TB对比健康对照更广泛的转录变化，共鉴定出1015个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），包括585个上调和430个下调基因。活动性TB对比健康对照仅鉴定出93个DEGs。活动性TB对比LTBI的比较具有最显著的差异表达谱，因此被选为主要分析发现队列。

**3.2 鉴定出94个与FerrDb来源铁死亡相关基因集相交的DEGs**

交集分析确定了94个活动性TB对比LTBI比较与FerrDb来源铁死亡相关基因集共有的DEGs，以及8个活动性TB对比健康对照比较与同一基因集共有的DEGs。两个DEG比较共享38个基因，但这些均未与铁死亡基因集重叠，因此三个集合间无共享基因。这一结果反映了差异表达分析的对照依赖性特征，应被解释为比较特异性发现。

**3.3 94个铁死亡相关交集基因的功能富集谱**

基因本体论（Gene Ontology, GO）生物学过程富集分析显示，这些基因主要富集于免疫和应激相关过程，包括应激应答的调节、对外部刺激应答的调节、防御应答和免疫系统过程。KEGG通路分析突出显示了脂质与动脉粥样硬化、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、谷胱甘肽代谢和TNF信号通路。Reactome通路分析显示富集于免疫系统、先天免疫系统、中性粒细胞脱颗粒、白细胞介素-4和白细胞介素-13信号传导、抗菌蛋白金属隔离、免疫系统中的细胞因子信号传导等。

**3.4 94个交集基因的PPI网络**

使用STRING构建的PPI网络显示出一个高度互联的中心区域，包含IL1B、TLR4、CXCL10、MMP9、CYBB、MPO、CD36、LCN2、S100A8和LTF等免疫和炎症相关基因。外周簇包含与脂质代谢、铁处理、氨基酸转运和应激调控相关的基因，如ACSL1、FABP5、ALAS2、FECH等。

**3.5 10个枢纽基因的功能富集谱**

对10个最终选定枢纽基因的GO生物学过程富集显示其与脂多糖应答、细菌来源分子应答、细菌应答、脂质应答及防御应答等密切相关。GO分子功能富集显示Toll样受体结合、肝素结合、脂多糖结合、模式识别受体活性等。GO细胞组分富集显示主要定位于分泌颗粒、吞噬囊泡、胞外空间等。

**3.6 10个枢纽基因的鉴定**

使用cytoHubba的MCC算法鉴定出IL1B、TLR4、MMP9、MPO、CYBB、LCN2、LTF、S100A8、CXCL10和CD36为前10位枢纽基因；Degree算法鉴定出IL1B、TLR4、CXCL10、MMP9、CYBB、MPO、CD36、ERBB2、SOD2和GATA3。两种算法有7个重叠基因：IL1B、TLR4、CXCL10、MMP9、CYBB、MPO和CD36。另根据与中性粒细胞活化、抗菌应答和金属隔离通路的生物学相关性保留LCN2、S100A8和LTF，最终确定10个枢纽基因面板。

**3.7 枢纽基因的外部验证结果**

外部验证显示两个数据集间的可重复性不同。LCN2和LTF在GSE28623和GSE62525中均表现出显著的正向差异表达，跨数据集重复性最强。IL1B、TLR4、MMP9和MPO在GSE62525中显著上调，且在GSE28623中显示一致的正logFC值但未达显著阈值。MMP9在GSE28623中logFC=0.933，调整后p=0.0544，接近但未达阈值。CXCL10、CYBB和CD36在两个数据集中均呈阳性但非显著。S100A8在GSE28623中显著上调但在GSE62525中呈小幅度负向非显著表达。

**4. 讨论与结论总结**

讨论部分指出，活动性TB与LTBI比较中鉴定出的94个铁死亡相关DEGs表明，铁死亡相关转录失调与从潜伏感染向活动性疾病转变的关系更为密切。富集结果与既往活性TB特征性炎症和先天免疫转录特征研究一致。10个枢纽基因中TLR4作为模式识别受体在识别病原体相关分子模式和激活下游炎症通路中发挥关键作用；IL1B和CXCL10佐证了铁死亡相关TB特征的炎症性质；中性粒细胞相关基因MMP9、LCN2、LTF、MPO和S100A8与既往发现的中性粒细胞驱动的TB转录特征相符。LCN2通过结合铁载体限制微生物铁获取，LTF是铁结合抗菌糖蛋白，两者在独立数据集中的一致性表达支持铁相关营养免疫在活动性TB中的重要性。CD36作为脂质摄取清道夫受体，将枢纽基因面板与脂质摄取和脂质失调联系起来。CYBB和MPO与活性氧产生和中性粒细胞抗菌应答相关。该研究提出的机制模型概述了M. tuberculosis感染可能通过TLR4诱导先天免疫活化、涉及IL1B和CXCL10的炎症信号传导、中性粒细胞相关基因参与活化脱颗粒和抗菌金属隔离，以及MMP9参与组织重塑的可能关系。然而，本研究的关键局限是未直接评估铁死亡，公共数据集不包含脂质ROS或脂质过氧化、细胞内不稳定铁、GPX4蛋白表达或活性、谷胱甘肽水平、脂质过氧化产物或药理学干预等测量指标，因此转录网络与铁死亡之间的联系仍属推测性质。

研究结论部分总结：本研究确定了活动性TB差异基因表达与FerrDb来源铁死亡相关基因集之间的转录交集。在活动性与潜伏性TB比较中鉴定出的1015个DEGs中，94个与铁死亡相关基因集相交。这些基因富集于免疫和应激反应过程，包括先天免疫信号传导、中性粒细胞相关应答、细胞因子信号传导、谷胱甘肽代谢和抗菌金属隔离。网络分析优先排序了10个主要免疫-炎症枢纽基因：IL1B、TLR4、CXCL10、MMP9、CYBB、MPO、CD36、LCN2、S100A8和LTF。外部验证显示跨数据集异质性可重复性，LCN2和LTF证据最强。重要的是，这些转录组学发现并不证明铁死亡性细胞死亡或在活动性TB中建立因果性铁死亡机制。未来需纳入脂质过氧化、铁稳态、GPX4/GSH状态和铁死亡特异性药理学拯救等直接测量的实验研究，以确定铁死亡是否在机制上参与TB相关宿主应答和疾病进展。