栽培草莓（*Fragaria × ananassa* Duch.）NLP家族基因的全基因组鉴定及其在高温和灰葡萄孢（*Botrytis cinerea*）胁迫下的表达分析

《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Wide Identification of NLP Family Genes in Cultivated Strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) and Analysis of Their Expression Under Heat and Botrytis cinerea Stresses

　　

结瘤起始（Nodule inception，NIN）类似蛋白（NIN-like proteins，NLPs）是植物特异性转录因子，调控养分吸收、生长发育及胁迫耐受性；然而，它们在胁迫响应中的作用尚未被充分阐明。栽培草莓（*Fragaria × ananassa* 'Camarosa'）是解析NLP基因进化与功能的理想模型。本研究在全基因组水平鉴定到37个FaNLP基因。系统发育分析将其划分为三个亚家族，且这些基因均匀分布于七条染色体上。分歧的外显子-内含子结构以及保守的基序组成暗示FaNLPs之间存在功能分化。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）揭示了高温胁迫和灰葡萄孢（*Botrytis cinerea*）感染条件下差异性的表达谱。值得注意的是，与'Benihoppe'品种相比，'Shuxing'品种中FaNLPs的上调程度显著更高。高温胁迫抑制了光合作用，并改变了过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及过氧化物酶（peroxidase，POD）的活性，而真菌感染则增强了两个品种的几丁质酶活性。与拟南芥和水稻的比较基因组学分析揭示了草莓中NLPs物种特异的进化模式。亚细胞定位预测表明FaNLP蛋白主要定位于细胞核，暗示其可能作为转录调控因子发挥作用。本研究将FaNLP序列特征与胁迫响应表型联系起来，为阐明草莓中NLP介导的调控网络奠定了基础。未来的功能实验，包括过表达与敲除分析，将进一步完善FaNLPs生物学功能的认识。

**栽培草莓NLP基因家族的全基因组鉴定与胁迫响应功能解析**

**1. 研究背景与科学问题**

植物在生长发育过程中持续遭受各类生物与非生物胁迫，严重制约作物的生长、发育和产量。高温胁迫和灰霉病（*Botrytis cinerea*感染）是草莓生产中最为突出的两大威胁因素。NLP（Nodule inception-like proteins，结瘤起始类似蛋白）作为植物特异性转录因子家族，已被证实参与调控养分吸收、生长发育和多种逆境响应。此前在拟南芥、水稻和番茄等物种中的研究表明，NLP家族成员在氮信号感知、同化及非生物胁迫应答中发挥核心作用，但其在生物胁迫（如真菌病害）中的功能研究仍极为有限。此外，栽培草莓作为高值经济园艺作物，其NLP基因家族尚缺乏系统鉴定。当前灰霉病防治主要依赖化学杀菌剂，但由此引发的病原菌抗药性和食品安全问题日益突出，挖掘草莓自身抗性基因并解析其调控机制，成为可持续育种的关键路径。为此，研究人员以栽培草莓（*Fragaria × ananassa* 'Camarosa'）为材料，在全基因组水平系统鉴定FaNLP家族成员，并比较了耐性差异品种'Shuxing'与'Benihoppe'在高温和灰葡萄孢胁迫下的表达特征与生理响应，旨在揭示FaNLP基因在草莓抗逆调控网络中的潜在功能。

**2. 研究内容概述**

本研究通过整合基因组学、比较进化分析和实验验证手段，鉴定到37个FaNLP基因（FaNLP1至FaNLP37），系统解析了其系统发育关系、染色体分布、保守结构域、顺式作用元件、基因复制事件及选择压力。同时，利用qRT-PCR技术检测了11个代表性FaNLP基因在两个栽培品种中经高温（40℃/28℃，14天）和灰葡萄孢接种（1×10⁶ conidia/mL，14天）处理后的表达动态，并结合光合参数（Pn、Tr、Gs、Ci）和抗氧化酶活性（CAT、SOD、POD）及几丁质酶活性和MDA含量的测定，关联基因表达与表型差异。

**3. 主要技术方法**

研究人员从GDR数据库获取'Camarosa'草莓基因组蛋白序列，利用HMMER（v3.3.2）搜索RWP-RK（PF02042）、GAF（PF22922）和PB1（PF00564）保守结构域，并通过CDD、SMART和InterPro数据库确认，最终确定NLP基因家族成员；序列特征分析借助Bioperl、MEME（v5.5.5）、GSDS 2.0、Wolf PSORT和Mapchart 2.32等工具；系统发育树由MEGA11分别以邻接法（NJ）和最大似然法（ML）构建，并利用Evolview优化展示；启动子区（ATG上游2000 bp）顺式作用元件经PlantCARE数据库预测；运用MCScanX进行共线性和重复事件分析，并通过KaKs_Calculator 2.0计算Ka/Ks值以评估选择压力。供试品种'Shuxing'为泰国品种'Parajatan'与日本品种'Benihoppe'杂交所得的F1代，由四川省农业科学院园艺研究所培育；胁迫处理后的叶片样本经液氮速冻，用于RNA提取和qRT-PCR分析，以FaUBC10为参考基因，采用2^?ΔΔCT方法计算相对表达量。

**4. 研究结果**

**4.1 NLP基因家族鉴定与基本特征分析**

全基因组鉴定共获得37个FaNLP基因。编码蛋白长度介于88至1057个氨基酸（aa）之间，分子量范围10.01至116.15 kDa，等电点跨度4.47至9.81。亚细胞定位预测显示大多数FaNLP蛋白定位于细胞核和叶绿体，仅FaNLP10和FaNLP23含跨膜螺旋，提示家族成员功能分化显著。

**4.2 系统发育与染色体定位**

利用164条NLP蛋白序列（涵盖拟南芥9条、草莓37条及蔷薇科其他物种118条）构建的进化树将FaNLP分为Group I（5个）、Group II（28个）和Group III（4个）三个亚家族。37个基因不均匀分布在七条染色体上，Fvb5-1含最多基因（5个），而多个染色体片段仅含1个基因，未见明显基因簇形成。

**4.3 保守基序与基因结构**

MEME分析鉴定到每个FaNLP蛋白含2至10个保守基序，其中Motif 1、4、9和13对应RWP-RK DNA结合域核心序列。同一亚家族成员具有相似的基序组成，而Group III和IV的基序数目较高，指示潜在的功能分化。所有FaNLP成员均具有RWP-RK和PB1结构域，但缺少GAF和NRD结构域，基因内含子数目为0至5个不等，部分基因（如FaNLP7、FaNLP1和FaNLP4）不含内含子。

**4.4 启动子顺式作用元件**

在FaNLP基因启动子区鉴定出ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif、LTR、MBS、G-box等多类顺式元件，分属激素响应、环境胁迫响应和光响应等类别，表明FaNLP可能受脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）等激素信号及逆境信号的协同调控。

**4.5 共线性与进化选择压力**

草莓基因组内共鉴定到52个FaNLP共线性基因对，片段重复是家族扩张的主要驱动力。与拟南芥相比，草莓NLP基因存在30个共线性区块，与水稻仅存在11个，说明FaNLP与双子叶植物亲缘关系更近。所有共线性同源基因对的Ka/Ks值均小于1，证实这些基因经历了强烈的纯化选择。

**4.6 高温与灰葡萄孢胁迫下的生理生化响应**

灰葡萄孢感染14天后，两个品种叶片出现褐色病斑，'Benihoppe'病斑范围更大。酶活测定显示，两个品种的几丁质酶、POD和SOD活性及MDA含量均显著升高，而CAT活性下降；'Shuxing'的SOD和CAT活性显著高于'Benihoppe'，且几丁质酶活性相对较低但抗氧化能力更强。高温胁迫下，'Benihoppe'的Pn显著下降而Ci、Tr和Gs升高，'Shuxing'的Pn和Tr下降而Gs升高；两品种CAT活性均降低，但'Shuxing'的CAT和SOD活性维持较高水平，表明两品种在抗热机制上存在差异。

**4.7 FaNLP基因在胁迫下的表达特征**

qRT-PCR分析显示，经高温胁迫和灰葡萄孢感染后，'Shuxing'品种中11个检测的FaNLP基因相对表达量均高于'Benihoppe'。其中，maker-Fvb5-4-augustus-gene-195.25、masked-Fvb1-3-processed-gene-66.56和masked-Fvb1-3-processed-gene-179.10三个基因在灰葡萄孢接种后的'Shuxing'中呈极显著上调。这表明FaNLP基因的高表达模式可能与'Shuxing'较强的耐热性和灰霉病抗性密切相关。

**5. 讨论与结论**

研究讨论部分指出，NLP基因家族的功能分化在不同物种间表现显著：草莓中FaNLP缺少GAF和NRD结构域，与辣椒（Capsicum annuum）和番茄（Solanum lycopersicum）中的发现一致，提示这些结构域可能并非所有植物NLP的必需功能模块。启动子区ABA-responsive（ABRE）与JA-responsive（CGTCA/TGACG）元件的存在，为FaNLP参与激素介导的胁迫响应提供了潜在调控依据。'Shuxing'品种中FaNLP基因的一致上调及其与SOD、CAT等抗氧化酶活性的协同增强，暗示FaNLPs可能通过调控抗氧化系统参与草莓耐热和抗病过程。研究最终得出结论：37个FaNLP基因的系统鉴定和比较基因组学分析描绘了草莓NLP家族独特的进化轨迹；qRT-PCR分析证实FaNLP基因在高温和灰葡萄孢胁迫下发生显著转录变化，表明其可能参与草莓对非生物高温胁迫和生物病原胁迫的响应；亚细胞定位预测支持FaNLP作为转录因子发挥核内调控功能的假说。该研究为草莓抗逆候选基因的筛选提供了初步的理论依据和基因资源。然而，由于当前结论主要基于生物信息学预测和转录水平分析，尚需通过亚细胞定位实验、蛋白质-DNA互作分析及遗传转化等手段，进一步验证FaNLP在耐热性和灰霉病抗性中的精确分子调控机制。