《International Journal of Molecular Sciences》：Genetic Code Expansion Enables Oriented, Site-Specific Conjugation of DARPins to Lipid Nanoparticles for Selective mRNA Delivery to CD8+ T Cells
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脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNPs）是递送治疗性载荷的有效平台，但其在体内靶向特定细胞群体的应用因缺乏特异性而受限。为应对这一问题，研究人员开发了一种基于蛋白–脂质偶联物后插入法构建靶向LNP的创新策略。通过基因密码扩展技术，将一个
脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNPs）是递送治疗性载荷的有效平台，但其在体内靶向特定细胞群体的应用因缺乏特异性而受限。为应对这一问题，研究人员开发了一种基于蛋白–脂质偶联物后插入法构建靶向LNP的创新策略。通过基因密码扩展技术，将一个对叠氮基-L-苯丙氨酸（p-azido-L-phenylalanine，pAzF）残基特异性引入靶向鼠CD8的DARPin（Designed Ankyrin Repeat Protein，设计锚蛋白重复蛋白）中，使其能够与二苯并环辛炔（dibenzocyclooctyne，DBCO）发生无铜点击化学反应，从而以DARPin偶联物功能化颗粒表面。DARPin-LNP表征结果显示，DARPin插入后颗粒尺寸得以保持，并获得了特征性负电荷，证实后插入法成功实现。使用原代小鼠脾脏T细胞的体外实验表明，靶向LNP选择性地转染CD8+ T淋巴细胞。这些数据表明，所开发的平台能够实现核酸对细胞毒性淋巴细胞的选择性体外递送，凸显了其在设计更安全的免疫治疗策略方面的潜在价值。
**论文解读：基于基因密码扩展与点击化学的DARPin-LNP靶向递送平台用于CD8
+ T细胞选择性mRNA递送**
**1. 研究背景与科学问题**
脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNPs）作为一种非病毒递送系统，具有低免疫原性、无病毒基因组整合风险及良好的生物相容性等优势，在RNA疗法和mRNA疫苗领域已得到广泛应用。然而，标准LNPs在体内系统性给药后主要非特异性地蓄积于肝脏和脾脏，缺乏组织特异性，严重限制了其精准治疗应用。为解决这一问题，研究者尝试通过修饰脂质组成来改变LNP的生物分布，但该策略难以实现针对特定细胞类型的精确靶向。因此，通过在LNP表面修饰能够识别靶细胞特异性受体的配体，成为实现精准递送的关键策略。DARPin（Designed Ankyrin Repeat Protein）作为一类基于天然锚蛋白重复序列的人工构建的小分子抗体模拟蛋白，具有分子量小（13–16 kDa）、无二硫键、热稳定性高及可在细菌系统中高产量表达等优点，是替代抗体的理想靶向配体。本研究选用能够特异性结合小鼠CD8（mCD8）受体的DARPin克隆MSE10作为模型配体，旨在开发一种新型的LNP表面功能化平台，实现对CD8
+ T淋巴细胞的选择性mRNA递送。
传统的蛋白-LNP偶联方法，如马来酰亚胺-硫醇键合，存在诸多局限性，包括偶联位点随机导致蛋白空间取向不可控、马来酰亚胺接头在生理条件下不稳定、易发生逆Michael反应和自发性水解，以及可能引发补体系统激活和全身毒性等。针对这些挑战，研究人员提出了一种基于基因密码扩展（Genetic Code Expansion，GCE）和铜-free点击化学（SPAAC）的创新策略，通过在DARPin序列的特定位点引入非天然氨基酸p-叠氮基-L-苯丙氨酸（p-azido-L-phenylalanine，pAzF），实现蛋白与LNP表面的位点特异性、定向偶联。
**2. 研究设计与技术方法**
本研究的主要技术路线包括以下几个关键环节：(1) 利用正交氨酰-tRNA合成酶/ tRNA系统在大肠杆菌中生物合成含pAzF的DARPin-pAzF融合蛋白，并通过肠激酶（hEKL）酶切去除亲和标签获得纯化的DARPin-pAzF；(2) 通过SPAAC反应将DARPin-pAzF与Cy5-DBCO荧光染料或DSPE-PEG(2000)-DBCO脂质偶联，形成蛋白-脂质偶联物IPAD-1；(3) 采用微流控混合技术制备封装eGFP mRNA的LNP-5平台（含SM-102和ALC-0315两种可电离脂质），并通过后插入法将IPAD-1嵌入预制LNP表面；(4) 使用动态光散射、Zeta电位、扫描透射电子显微镜（STEM）等手段对纳米颗粒进行理化性质表征；(5) 在原代小鼠脾脏T细胞上进行体外转染实验，通过流式细胞术评估靶向递送效率和特异性。小鼠脾细胞样本取自8周龄雌性Balb/c小鼠，动物实验经Sirius科技大学伦理委员会批准。
**3. 研究结果**
**3.1 pAzF的DARPin基因编码**
研究人员成功构建了共转化两个质粒的大肠杆菌T7 Express生产菌株，其中一个质粒携带含琥珀终止密码子的DARPin基因，另一个携带正交的AzFPylRS/tRNA对。通过SDS-PAGE和电喷雾电离质谱确认了DARPin-pAzF融合蛋白的成功表达，产量达30 mg/L。为去除亲和标签，研究人员开发了高效的人源肠激酶（hEKL）生产工艺，通过引入C112S突变、与硫氧还蛋白A融合表达、利用SHuffle? T7 Express菌株及GroEL/GroES伴侣系统等措施，成功获得具有活性的hEKL。经酶切和阴离子交换层析纯化后，DARPin-pAzF纯度达到90%，产量为25 mg/L培养液。
**3.2 SPAAC方案的验证**
以Cy5-DBCO荧光染料作为模型底物验证SPAAC反应的特异性和效率。凝胶电泳和荧光成像显示，DARPin-AzF与Cy5-DBCO高效偶联，偶联效率约90%，而野生型DARPin无荧光信号，证实了偶联的特异性。流式细胞术分析表明，通过SPAAC偶联Cy5的DARPin能够有效结合小鼠T细胞表面的CD8受体，并清晰区分CD8
+与CD4
+细胞群，证明C端偶联不影响DARPin的受体结合亲和力。
**3.3 DARPin修饰脂质纳米颗粒的制备与表征**
研究系统比较了LNP-5在不同缓冲液（PBS和Tris-HCl）中经不同比例IPAD-1（0.10和0.27 mol%）后插入修饰后的理化性质。Zeta电位测量显示，未修饰LNP-5呈弱正电荷（+5.5 mV），而修饰后颗粒表面电荷反转至?10至?20 mV，证实IPAD-1成功嵌入脂质双层外层。经Tris-HCl缓冲液处理后得到的0.10 mol% IPAD-1配方具有最优胶体性质（Z-average约83 nm，PDI约0.10，包封率90–100%），而PBS缓冲液处理导致颗粒形态破坏和无定形碎片形成。STEM显微照片进一步确认了Tris-HCl缓冲液中颗粒保持球形形态并形成粗糙的多孔表面层。该最优配方被选定用于后续功能研究。
**3.4 点击化学实现与马来酰亚胺偶联相当的CD8
+靶向效率**
体外转染实验比较了未修饰LNP、被动吸附DARPin的LNP和分别通过点击化学（IPAD-1）或马来酰亚胺-硫醇键偶联anti-CD8 DARPin的LNP对原代小鼠脾脏T细胞的转染选择性。结果显示，未修饰LNP和被动吸附DARPin的LNP非特异性转染CD4
+和CD8
+两种淋巴细胞群，CD8/CD4比例仅为1.7±0.07。相比之下，两种定向偶联的LNP均使CD8
+靶细胞群中GFP阳性比例显著增加，同时将CD4
+细胞的非特异性转染降至背景水平，CD8/CD4选择性指数达到约90。用商业抗CD8抗体（克隆53-6.7）预先封闭受体可将转染效率降低约20倍至几乎为零。这些结果表明，基于SPAAC点击化学的偶联策略在靶向效率和特异性方面与经典马来酰亚胺偶联方法相当。
**4. 讨论与结论**
本研究开发并验证了一种基于DARPin-LNP的新型靶向递送平台。与传统的随机化学偶联方法相比，该平台的核心优势在于通过基因密码扩展技术在DARPin蛋白C末端特定位点引入pAzF，实现了蛋白与LNP表面的定向、位点特异性偶联，确保蛋白活性位点充分暴露。SPAAC反应在温和的生理条件下进行，避免了铜离子催化剂引起的细胞毒性。后插入法相较于直接修饰法更为简便，且不会导致包封内容物泄漏。缓冲液类型对颗粒完整性至关重要，Tris-HCl相比PBS更能保持修饰后颗粒的结构稳定性。与已有研究相比，本研究使用的SM-102/ALC-0315混合可电离脂质配方表现出较高的基础转染效率，但其本身不具备细胞选择性，只有通过共价偶联实现定向配体展示才能赋予颗粒靶向特异性。虽然配体表面密度等参数尚未定量，该平台作为一种通用技术，可推广至其他重组蛋白和多肽，为mRNA疫苗、体内CAR-T细胞工程和基因编辑等精准医学应用提供了统一化学工具包。研究结论表明，基于pAzF位点特异性引入和生物正交点击化学的LNP功能化策略是一种通用平台技术，能够实现纳米载体的可控空间定向功能化，在精准递送领域具有广泛的应用前景。
