《International Journal of Molecular Sciences》：Multi-Omics Analysis Reveals Molecular Networks and Key Pathways Associated with Cysteine- and Methionine-Mediated Biosynthesis of Sulfur-Containing Flavor Metabolites in Lentinula edodes
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香菇（Lentinula edodes）以其独特香气著称，其香气特征由多种挥发性含硫风味代谢物（SCFMs）体现。半胱氨酸与甲硫氨酸能够增强香菇中SCFMs的生物合成，但其潜在代谢通路仍不清楚。为弥补这一空白，研究人员开展了整合蛋白质组学与代谢组学分析，以阐明
香菇（Lentinula edodes）以其独特香气著称，其香气特征由多种挥发性含硫风味代谢物（SCFMs）体现。半胱氨酸与甲硫氨酸能够增强香菇中SCFMs的生物合成，但其潜在代谢通路仍不清楚。为弥补这一空白，研究人员开展了整合蛋白质组学与代谢组学分析，以阐明半胱氨酸与甲硫氨酸调控SCFMs生物合成的通路。结果表明，外源补充半胱氨酸与甲硫氨酸显著提高了香菇关键香气化合物lenthionine的含量。两种处理均诱导了蛋白质组与代谢组谱系的显著变化。蛋白质组分析显示，半胱氨酸处理后差异表达蛋白主要富集于半胱氨酸与甲硫氨酸代谢及硫代谢，而甲硫氨酸处理主要影响与色氨酸代谢和硫代谢相关的蛋白。代谢组分析表明，差异积累代谢物显著富集于D-氨基酸代谢和半胱氨酸与甲硫氨酸代谢，其中谷胱甘肽代谢仅在半胱氨酸处理下特异性富集。整合组学分析进一步揭示了不同硫营养条件下独特的硫代谢物-蛋白调控网络，并鉴定出处理特异性的枢纽蛋白。这些发现建立了一个分子调控框架，将SCFMs生物合成与涉及硫中间体生成与调控的更广泛初级代谢通路联系起来，为理解香菇中SCFMs形成的潜在调控网络提供了新见解。
研究背景方面，香菇（Lentinula edodes）是全球第二大栽培食用真菌，其典型香气主要由挥发性含硫风味代谢物（SCFMs）构成，包括1,2,4-三硫杂环戊烷、lenthionine（1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷）、二甲基二硫等，占鲜菇总挥发物19.41%–21.53%，干菇可达22.91%–74.74%。已知SCFMs生物合成经历γ-谷氨酰转肽酶（GGT）与半胱氨酸亚砜裂解酶（CSL）催化的两步酶促反应及后续非酶促缩合裂解，但lentinic acid起源不明，且SCFMs与初级硫代谢（硫代谢 ko00920、半胱氨酸与甲硫氨酸代谢 ko00270、谷胱甘肽代谢 ko00480）的协调关系尚处起步阶段。既往研究提示外源半胱氨酸、甲硫氨酸及无机硫可促进1,2,4-三硫杂环戊烷生成，半胱氨酸效应最强，但未检测lenthionine及完整硫挥发谱，分子机制缺乏直接证据。为此，研究人员以香菇0912菌株菌丝为模型，在剔除背景半胱氨酸/甲硫氨酸的改良MMN培养基中，施加0.6 g/L半胱氨酸（Cys）与0.2 g/L甲硫氨酸（Met），整合蛋白质组与代谢组学解析调控网络。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
主要关键技术方法方面，研究人员采用香菇0912菌株，设无Cys/Met改良MMN固体与液体培养体系，液体培养补硫氨基酸12 h后取样；以HPLC-VWD定量lenthionine，商业试剂盒测GGT/CSL酶活及胞内半胱氨酸，qPCR检ggt1–3与csl1–3转录；非靶向蛋白质组基于Orbitrap Astral DIA（MaxLFQ定量，FC≥1.2或≤0.83且p≤0.05筛差异表达蛋白DEP）；非靶向代谢组基于UHPLC-Q Exactive正负离子模式（OPLS-DA VIP≥1、FDR≤0.05、FC≥1.2或≤0.83筛差异积累代谢物DAM）；整合分析采用Procrustes检验、sPLS关联、igraph模块识别与Cytoscape cytoHubba（MCC算法）定枢纽蛋白，并以qPCR补转录验证。
研究结果部分，2.1节外源Cys与Met对菌丝生长的影响表明，0.3–0.9 g/L Cys均促菌落扩展，0.2/0.4 g/L Met无显著影响，0.6 g/L Met抑制生长，选定0.6 g/L Cys与0.2 g/L Met进入后续实验。2.2节外源Cys与Met增强lenthionine合成显示，两处理显著提升胞内半胱氨酸、lenthionine含量及GGT/CSL酶活，qPCR中Cys最强上调ggt1–3，Met最强上调csl1，Cys主导csl2–3，证实二者差异化转录-酶活调控。2.3节蛋白质组谱系改变经PCA区分，Cys vs 对照获1090 DEP（618上/472下），Met vs 对照929 DEP（512上/417下），共有340上/242下，热图分六簇，C4–C6在补硫下高表达。2.4节KEGG富集揭示Cys特异走甘油酯代谢、Cys/Met代谢、植物次生代谢物生物合成、氰基氨基酸代谢；Met特异走鞘脂生物合成、其他聚糖降解、色氨酸代谢、半乳糖代谢；共有通路含硫代谢。Cys特异上调5谷胱甘肽S-转移酶（GST）、Cys/Met PLP依赖酶、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶、GGT；Met特异上调吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶。2.5节代谢组PCA分离明显，Cys获463上/339下DAM，富集谷胱甘肽代谢、D-氨基酸代谢、Cys/Met代谢、辅因子生物合成；Met获332上/263下DAM，富集氰基氨基酸、嘧啶、核苷酸代谢及共有D-氨基酸/Cys-Met/辅因子通路，TOP30 VIP中硫代谢物Cys组12、Met组14、共有4。2.6节整合分析Procrustes显示硫DAM与DEP强关联，Cys建6模块、Met建4模块，按功能缩为各2模块；Top10枢纽蛋白仅p04275、p05403共有，Cys网络独含ATP-sulfurylase、亚硝酸/亚硫酸还原酶4Fe-4S域蛋白，Met网络独含GST、芳基磺基转移酶，五者属吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶；qPCR与蛋白量弱相关，提示转录后调控。
讨论部分总结，研究人员指出外源有机硫充足时硫酸盐同化蛋白（sat、cysC、cysH、cysI）下调属硫代谢反馈抑制与硫代谢物阻遏的稳态适应；MetK受Met下调但SAM升1.5倍，符合产物稳态而非底物抑制；菌丝阶段已具备GGT-CSL轴与lenthionine前体供应，但子实体发育会重塑网络，菌丝枢纽节点为保守硫流节点。GST不直接产lenthionine，但通过谷胱甘肽/半胱氨酸硫流与氧化还原维持间接上游调控；PAPS介导鞘脂与硫风味关联待证。
结论部分翻译：本研究证实外源半胱氨酸与甲硫氨酸补充显著促进香菇lenthionine积累，并诱导菌丝蛋白质组与代谢组广泛改变。整合蛋白质组与代谢组学分析揭示半胱氨酸与甲硫氨酸通过差异代谢通路及代谢物-蛋白调控网络调节含硫风味代谢物生物合成，并鉴定若干候选枢纽蛋白与中间代谢物。发现构建了连接SCFMs生物合成与初级代谢通路及相关硫中间体的整合分子框架，为香菇SCFMs形成潜在调控网络提供新见解。
