《International Journal of Molecular Sciences》：Bioinformatic Analysis of Bacillus pacificus B630: Molecular Understanding of Biofilm Production
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本研究旨在测定太平洋芽孢杆菌（Bacillus pacificus）B630和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ATCC 14579的生物膜产生能力及运动性，并利用生物信息学工具进行比较基因组分析，以理解两株菌之间的差异。生物膜产生实验采用番红染色
本研究旨在测定太平洋芽孢杆菌（Bacillus pacificus）B630和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ATCC 14579的生物膜产生能力及运动性，并利用生物信息学工具进行比较基因组分析，以理解两株菌之间的差异。生物膜产生实验采用番红染色的玻璃试管法进行；运动性通过半固体琼脂测定。生物信息学分析利用两株菌的基因组信息，包括直系同源基因的鉴定、eps1和sipW-tasA-calY操纵子基因间的相似性，以及SipW和TasA蛋白的结构预测。太平洋芽孢杆菌B630在玻璃表面产生的生物膜量显著高于蜡状芽孢杆菌ATCC 14579（p < 0.01）。此外，太平洋芽孢杆菌B630的运动性显著低于蜡状芽孢杆菌ATCC 14579（p < 0.001）。太平洋芽孢杆菌B630含有45个非共享基因，而蜡状芽孢杆菌ATCC 14579含有27个非共享基因。eps1和sipW-tasA-calY操纵子基因间存在相似性差异。SipW和TasA蛋白的序列差异可能影响蛋白质结构预测结果。在SipW中，序列差异可能影响C-末端区域。在TasA中，两株菌蛋白的β-折叠片数量存在差异，并在高聚集倾向区域发现氨基酸替换。与生物膜产生相关的基因组差异可能解释所研究菌株间生物膜产生的差异。
# 太平洋芽孢杆菌B630与蜡状芽孢杆菌ATCC 14579生物膜产生差异的基因组学与结构生物学解析
## 一、研究背景与科学问题
蜡状芽孢杆菌群（Bacillus cereus group），又称蜡状芽孢杆菌广义种（B. cereus sensu lato, s.l.），是芽孢杆菌属（Bacillus）内一个物种复合群，包含至少21个物种，归属12个基因组种。该群成员均为革兰氏阳性、兼性厌氧或好氧、可形成内生孢子的低GC含量细菌，归属于厚壁菌门（Firmicutes），并具有高度遗传相似性。尽管遗传背景高度相近，基因组差异却推动了群内菌株的多样化，其中包括具有临床、经济和食品相关重要性的菌株。蜡状芽孢杆菌狭义种（B. cereus sensu stricto, s.s.）是食源性中毒的已知病原，可引起呕吐型和腹泻型综合征、严重的非胃肠道感染及食品腐败；炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）是炭疽病的病原体；苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）被用作生物杀虫剂。此外，该群也包含有益菌株，如植物促生菌和益生菌。
蜡状芽孢杆菌广义种菌株能够合成多种毒力因子，包括毒素、形成抗性内生孢子以及产生生物膜（biofilm）。生物膜被视为环境持久性机制，在食品工业中，生物膜形成被认为是食品生产过程中系统性污染的潜在来源。既往研究表明，B. cereus ATCC 10987菌株（目前重新分类为太平洋芽孢杆菌B. pacificus ATCC 10987）比B. cereus ATCC 14579产生更多的生物膜。研究人员所在课题组从大米样品中分离到一株能在玻璃表面产生丰富生物膜的B. pacificus菌株，后续研究显示B. pacificus B630菌株在蛋壳表面比B. cereus ATCC 14579产生更多生物膜。
基于上述背景，本研究旨在测定B. pacificus B630与B. cereus ATCC 14579的生物膜产生能力和运动性，并通过生物信息学工具进行比较基因组分析，以理解两株菌之间的分子差异。
## 二、主要技术方法
本研究采用多种实验和生物信息学技术手段。生物膜产生实验采用番红染色的玻璃试管法，在BHI肉汤（含1%葡萄糖）中于30°C静置培养48小时后，以0.1%番红染色60分钟，经乙醇溶解后于590 nm测定吸光度。运动性测定在半固体BHI培养基（含0.5%琼脂）上进行，30°C培养24小时后测量菌落直径。统计分析采用独立样本Student's t检验。基因组分析方面，从GenBank数据库获取两株菌的基因组序列，使用OrthoVenn3网络服务器进行直系同源基因聚类分析，通过VFDB数据库鉴定胞外多糖合成相关基因，利用BLASTn算法进行基因间核苷酸相似性比较，以SnapGene进行基因组组织可视化。蛋白质结构分析采用Protter网络服务器预测跨膜拓扑结构，Clustal Omega进行多序列比对，AlphaFold3进行三维结构预测，GalaxyWeb进行结构优化，SAVES v.6.1平台的PROCHECK工具生成拉马钱德兰图进行结构质量验证，VMD和ChimeraX用于结构可视化和交互分析，JPred3和FoldUnfold用于二级结构和无序区域预测。
## 三、研究结果
### 3.1 生物膜产生与运动性测定
实验结果显示，B. pacificus B630在玻璃表面产生的生物膜量显著高于B. cereus ATCC 14579（p < 0.001）。相反，B. pacificus B630的运动性显著低于B. cereus ATCC 14579（p < 0.001）。这一表型差异为后续基因组分析提供了实验基础。
### 3.2 直系同源基因家族比较分析
直系同源基因分析揭示两株菌共享4189个基因，符合B. cereus广义种高遗传相似性的定义。B. pacificus B630包含45个非共享基因，而B. cereus ATCC 14579有27个非共享基因。B. pacificus B630独有基因涉及细胞壁组织和代谢途径（芳香族化合物、DNA、RNA和碳水化合物/多糖代谢），而B. cereus ATCC 14579独有基因涉及代谢（含氮化合物、醇类、有机酸和芳香族化合物代谢）和致病性（铁载体和溶血素产生），提示两株菌在环境适应和致病潜力方面存在分化。
### 3.3 生物膜产生相关基因分析
基于VFDB分析，B. pacificus B630含有与B. cereus ATCC 14579中eps1操纵子同源的荚膜多糖合成相关基因BC5263、BC5264、BC5265、BC5274、BC5275、BC5276、BC5277、BC5278和BC5279。尽管两株菌均携带直系同源的eps1操纵子基因，但B. pacificus B630的eps1直系同源基因核苷酸一致性为83.99%~93.65%，且操纵子基因组区域存在菌株特异性基因。对于sipW-tasA-calY操纵子，B. pacificus B630的sipW、tasA和calY基因相对B. cereus ATCC 14579的核苷酸一致性分别为89.14%、78.43%和84.51%。系统发育分析显示sipW-tasA-calY区域的核苷酸保守性维持在物种水平，B. pacificus B630的这一基因组区域与其他B. pacificus菌株聚为一支。
### 3.4 SipW蛋白拓扑学、建模与结构比较分析
SipW蛋白被鉴定为内质网（ER）亚家族I型信号肽酶成员。两株菌的SipW蛋白均含有N-末端和C-末端两个跨膜结构域，C-末端区域表现出更大的变异性，包含跨膜结构域、胞外环和胞质尾部。催化三联体残基丝氨酸-51、组氨酸-91和天冬氨酸-110在B. subtilis直系同源蛋白中已被证实为肽酶活性所必需。AlphaFold3结构预测显示SipW蛋白在C-末端位置存在构象变化。既往研究表明，缺失SipW蛋白最后20个氨基酸的突变株表现出黏附缺陷，但不影响漂浮生物膜中TasA在气液界面的积累，说明该区域不参与肽酶活性但参与黏附能力，并调控其他胞外基质相关基因（如epsA-O操纵子）的表达。
### 3.5 TasA蛋白结构与功能分析
TasA蛋白最初以前蛋白形式合成，含约27个氨基酸的信号肽。两株菌的TasA均含有长度为27个氨基酸的信号肽，在第4~6位存在三赖氨酸基序。B. subtilis中TWA│AFND（Thr-Trp-Ala│Ala-Phe-Asn-Asp）基序内的双丙氨酸在B. cereus ATCC 14579和B. pacificus B630中均不保守，仅保留第一个丙氨酸及部分侧翼残基（TxAxFxD），因此无法仅凭序列同源性推断两株菌中TasA的精确切割位点。二级结构预测显示两株菌的TasA均包含β-折叠区域和四个α-螺旋，其中两个为3?螺旋，符合淀粉样蛋白jelly-roll折叠的一般特征。B. cereus ATCC 14579的TasA比B. pacificus B630多一个β-折叠。在高聚集倾向区域LG-13（Leu78–Gly90）和DG-14（Asp104–Gly117）中，仅Leu78和Asp104保守，Gly90和Gly117存在差异，且两株菌之间也存在差异。AlphaFold3模型显示N90D和V117I替换属保守氨基酸替换，但预测会改变局部静电性质，可能影响氢键形成和离子相互作用，然而这些观察基于静态单体模型，无法捕捉纤维聚合过程中的构象重排和供体链交换机制。
## 四、讨论与结论
本研究鉴定出B. cereus ATCC 14579与B. pacificus B630在生物膜产生和运动性方面的表型差异，并在基因组和分子预测水平发现了相应差异。eps1操纵子的核苷酸一致性差异和菌株特异性基因插入可能影响运动性表型，但需通过表达分析（如RT-qPCR）或功能实验加以确证。SipW蛋白C-末端区域的差异可能影响底物黏附能力而非肽酶活性，这与生物膜在玻璃表面的黏附测定结果相关联。TasA蛋白的β-折叠数量差异和氨基酸替换可能影响淀粉样纤维的形成和聚合效率，但需通过分子动力学模拟或纤维聚集实验加以验证。
综上，与生物膜产生相关的基因组差异可解释所研究菌株间的表型差异。未来在转录组学和蛋白质组学水平的深入探索将有助于更全面地阐明这些菌株生物膜产生的分子机制。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
