婴儿利什曼原虫在意大利南部微小白蛉种群中的靶向分子筛查

《International Journal of Molecular Sciences》：Targeted Molecular Screening of Leishmania infantum in Sergentomyia minuta Populations from Southern Italy

　　

摘要
微小白蛉（Sergentomyia minuta）是一种广泛分布的地中海白蛉，传统上被认为嗜爬行动物血，且在人类利什曼病传播中意义有限。在Sergentomyia属物种中偶尔检测到哺乳动物利什曼原虫（Leishmania）DNA，这一发现对该传统假设提出了挑战。本研究旨在调查意大利南部城市周边地区微小白蛉的丰度、宿主取食行为及婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）DNA的分子检测情况。研究人员采用粘性诱捕器在意大利卡塔尼亚地区的三个采样点采集白蛉。未吸血雌蛉采用ITS1和SSU rRNA标记物筛查利什曼原虫属（Leishmania spp.）DNA。ITS1 PCR-RFLP仅用于区分婴儿利什曼原虫相容性分子谱型与非婴儿利什曼原虫分子谱型。对吸血雌蛉采用线粒体细胞色素b标记物（CytB1和CytB2）及人类特异性核转甲状腺素蛋白（TTR）标记物，通过PCR-RFLP和多重PCR分析血餐来源。研究共采集1361只微小白蛉标本，性别比例明显偏雌性。在相当比例的混合样本中检测到利什曼原虫属DNA。ITS1 PCR-RFLP谱型显示异质性分子模式，一致排除婴儿利什曼原虫，而与多种非婴儿利什曼原虫锥虫科（trypanosomatid）DNA相容。血餐分析表明其取食多种脊椎动物宿主，包括偶尔检测到人类线粒体DNA，而核TTR标记物始终为阴性，可能反映了血液消化过程中DNA的降解。意大利南部的微小白蛉种群表现出高丰度、生态可塑性以及与城市周边栖息地的密切关联。研究结果细化而非推翻当前对微小白蛉在地中海生态系统中流行病学作用的认识。多位点分子筛查揭示了异质性非婴儿利什曼原虫锥虫科DNA模式，但未检测到婴儿利什曼原虫存在的证据。虽然偶尔可检测到人类血餐，但微小白蛉对人类利什曼病的流行病学意义仍未得到证实。这些发现强调了综合昆虫学与分子学方法在地中海生态系统媒介—寄生虫—宿主关系谨慎解读中的重要性。

微小白蛉（Sergentomyia minuta）在地中海利什曼病传播中潜在作用的研究解读

一、研究背景与意义

利什曼病是由利什曼原虫属（Leishmania）鞭毛原生动物引起的一组人兽共患寄生虫病，在全球约90个国家流行，估计每年新增60万至100万例皮肤利什曼病病例，约14600人死亡。在地中海盆地，婴儿利什曼原虫（L. infantum）是意大利唯一持续报道的物种，也是人类和犬利什曼病的主要病原体。传统认为，白蛉科中仅白蛉属（Phlebotomus）负责地中海地区利什曼病的传播，而Sergentomyia属被认为仅以冷血动物（如蜥蜴和壁虎）为食。然而，多项研究在Sergentomyia属中检测到哺乳动物利什曼原虫DNA，并在其中肠鉴定出爬行动物和哺乳动物血餐，挑战了传统认知。微小白蛉（Sergentomyia minuta）作为意大利广泛分布且在东西西里岛部分地区占比高达70%的优势物种，此前曾在葡萄牙和意大利被检测到携带婴儿利什曼原虫DNA，引发了对该物种可能参与婴儿利什曼原虫传播循环的关注。然而，根据Maia和Depaquit的标准，一种昆虫必须同时具备携带和传播病原体以及取食易感宿主血液的能力才能被认定为有效传播媒介。因此，仅检测到利什曼原虫DNA不足以证实其传播媒介地位，还需鉴定其是否取食人类或其他哺乳动物血液。西西里地区是利什曼病高度流行区，犬血清阳性率高达60%，约47%的人口生活在风险区域，开展微小白蛉流行病学意义的研究具有重要的公共卫生价值。本研究旨在调查意大利南部城市周边地区微小白蛉的丰度、宿主取食行为及婴儿利什曼原虫DNA的存在情况，以评估该物种是否参与当地内脏利什曼病的传播循环。

二、研究技术与方法

本研究采用多种关键技术方法：第一，在意大利卡塔尼亚地区设置三个采样点（S1、S2和PLN1/2），于2018年10月至2019年9月分两个采集季节使用粘性诱捕器采集白蛉，通过二分检索表进行形态学鉴定和性别判定。第二，对未吸血雌蛉采用MagCore自动核酸提取仪进行基因组DNA提取，分别使用ITS1和SSU rRNA两个分子标记物进行利什曼原虫属DNA筛查，并通过ZBJ标记物确认白蛉DNA完整性和存在。第三，采用HaeIII限制性内切酶进行ITS1 PCR-RFLP分析，区分婴儿利什曼原虫与非婴儿利什曼原虫分子谱型。第四，对吸血雌蛉采用线粒体细胞色素b标记物（CytB2和CytB1）进行PCR扩增和限制性酶切分析鉴定血餐来源，同时采用多重PCR检测人类特异性核TTR基因和节肢动物ZBJ基因作为方法学对照。第五，采用Pearson卡方检验分析各采样点间阳性率差异，显著性水平设定为p<0.05。

三、研究结果

3.1 昆虫学调查与微小白蛉种群结构

研究共采集1361只微小白蛉标本，其中雌性1041只，雄性320只，总体雌雄比为0.31，性别比例明显偏雌性。三个采样点中雌性均显著多于雄性。S3采样点雌性丰度最高，占全部雌性采集量的63.82%，其次是S1（23.51%）和S2（12.67%）。值得注意的是，S3是人为干扰程度最高的区域，是该研究中唯一以排水管而非墙壁缝隙为主要栖息场所的采样点。吸血雌蛉仅在S1和S3检测到，分别为5只（1.6%）和27只（4.9%），S2未记录到吸血个体。卵巢发育个体在所有采样点均有观察，但占比极低。这些结果表明，尽管雌性丰度持续较高，但种群中仅有少数个体表现出近期吸血或卵发育的证据。

3.2 微小白蛉中利什曼原虫属DNA的检测与分子鉴定

研究人员将250只未吸血雌蛉按每池5只分为50个混合池进行筛查。ITS1标记物检测显示总体阳性率为52%，其中S1为46.7%（7/15）、S2为60.0%（6/10）、S3为52.0%（13/25），三个采样点间无统计学显著差异（χ²=0.427，df=2，p=0.808）。在ITS1阳性池中，未观察到任何池呈现典型的婴儿利什曼原虫特异性ITS1谱型。19%的样本检测到约400bp的非典型片段，31%的样本呈现约350bp和约400bp的双条带模式。约400bp扩增子在已知利什曼原虫物种中未见报道，提示存在非婴儿利什曼原虫谱系或显著的种内变异。对ITS1阴性池进一步采用更敏感的SSU rRNA标记物检测，额外检出8%的阳性样本，使利什曼原虫属DNA总体检出率提高至56%。ITS1和SSU联合应用提高了诊断灵敏度，揭示了单一基因座方法无法检测到的遗传多样性。

3.3 RFLP分析揭示遗传异质性和婴儿利什曼原虫的缺失

对ITS1 PCR产物进行HaeIII酶切RFLP分析，82%的扩增子成功消化，18%保持未消化状态。产生单一约350bp ITS1扩增子的样本经HaeIII消化后产生三个限制性片段，与除婴儿利什曼原虫外的利什曼原虫物种限制性谱型一致。任何样本均未显示婴儿利什曼原虫特征性限制性模式（190、80和50bp条带），独立证实了该人畜共患物种在所分析种群中的缺失。约400bp的ITS1扩增子对HaeIII消化完全抵抗；在双条带模式（350-400bp）样本中，消化仅影响350bp片段而400bp片段保持完整。这种差异酶切行为支持约400bp片段代表与常见利什曼原虫物种不同的非婴儿利什曼原虫遗传谱系的假说。总体而言，微小白蛉中检出的利什曼原虫相关DNA呈现显著遗传异质性，但系统性排除了婴儿利什曼原虫。

3.4 微小白蛉血餐中脊椎动物宿主的分子鉴定

对26只吸血雌蛉进行血餐来源鉴定。CytB2标记物扩增成功率为81%，RFLP分析显示不同限制性模式，其中一例呈现混合血餐特征，包括山羊DNA的特征性谱型（400和170bp条带），表明微小白蛉取食多种哺乳动物宿主并可能获得混合血餐。未检测到与人DNA相容的CytB2/HaeIII模式。CytB1标记物扩增成功率为100%，经XhoI酶切后产生人类宿主特征性限制性谱型（210和140bp条带），确认了人类血餐的存在。部分样本同时存在消化和未消化片段，与白蛉血餐中检出人类DNA的线粒体异质性一致。多重PCR检测中，所有样本均为ZBJ阳性而TTR阴性，人类核DNA在血餐中不可检测，这归因于线粒体DNA和核DNA在拷贝数和降解动力学上的差异，并非方法学局限。综合结果表明，微小白蛉虽然不被视为主要嗜人性物种，但能够取食包括人类在内的哺乳动物。

四、讨论与结论

本研究表明，意大利南部卡塔尼亚地区的微小白蛉种群表现出高丰度、显著的雌性偏向性别比例和较强的生态可塑性。S3（最有城市化的采样点）的最高雌性丰度表明该物种可与城市环境建立密切联系，人工栖息场所和丰富的脊椎动物宿主为维持高密度种群提供了有利条件。雌性偏向的性别比例可能与日间栖息地采样方法富集雌性、城市化微栖息地扩大人工庇护所和宿主可获得性以及光诱法等方法学差异有关。

多位点分子筛查揭示了高比例的锥虫科DNA阳性率（56%），但所有阳性样本经ITS1 PCR-RFLP分析均与非婴儿利什曼原虫锥虫科DNA模式相容，未检测到婴儿利什曼原虫存在的分子证据。约400bp非典型扩增子对HaeIII消化抵抗，可能对应爬行动物相关的利什曼原虫（如L. tarentolae）、其他双宿主锥虫或单宿主属（如Leptomonas），以及潜在混合或降解模板，而非新型或隐秘利什曼原虫谱系。SSU rRNA标记物额外检出的阳性样本表明单一位点筛查可能低估寄生虫感染率，多基因座联合策略更受推荐。

血餐分析显示微小白蛉偶尔取食人类血液，但线粒体DNA阳性与核DNA阴性的不一致结果提示这种取食行为具有偶发性而非系统性偏好，可能是机会性取食行为而非固定的宿主偏好。流行病学上，偶尔的人血取食虽可能增加传播人类病原体的潜在风险，但在本研究的条件下，微小白蛉在婴儿利什曼原虫传播中的作用似乎有限。

本研究结论明确指出，研究结果细化而非推翻当前对微小白蛉在地中海生态系统中流行病学作用的认识。该物种虽然频繁携带非婴儿利什曼原虫锥虫科DNA，但未检测到婴儿利什曼原虫（地中海盆地人类利什曼病的主要病原体）的分子证据，不支持其在婴儿利什曼原虫局部传播中发挥作用。研究采用的多位点检测、RFLP分析和血餐鉴定相结合的策略为评估白蛉种群的生态学特征和流行病学潜力提供了稳健框架，并强调了结合序列分析和下一代测序技术在未来研究中的重要性，以更精确地解析媒介—寄生虫—宿主相互作用的复杂性。