6PPD与6PPD-Q诱导酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体功能障碍

《International Journal of Molecular Sciences》：6PPD and 6PPD-Q Induce Mitochondrial Dysfunction in Saccharomyces cerevisiae

　　

N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-对苯二胺（6PPD），通常称为6PPD，是一种轮胎抗臭氧剂，用于防止橡胶氧化和降解。当6PPD与臭氧反应时，会转化为6PPD-醌（6PPD-Q）。雨水路面径流促进了苯二胺类化合物（PPDs）向环境中的迁移。近年来，6PPD-Q已被确定为一种急性环境毒物，对水生生物造成重大破坏。为了促进关于PPDs作用机制的知识增长，并可能支持环境法规的制定，本研究旨在阐明6PPD和6PPD-Q在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的毒性效应。为实现这一目标，研究人员进行了生长测定、RNA测序、线粒体染色和RT-qPCR实验。结果表明，6PPD和6PPD-Q通过使氧化磷酸化途径的复合物III、IV和V失调来影响生长和基因调控。此外，6PPD和6PPD-Q在不同pH值和不同培养基中似乎会发生聚集。6PPD-Q的聚集可能抑制细胞摄取，导致较不明显的毒性效应。综上所述，研究人员可以推断6PPD和6PPD-Q在暴露于芽殖酵母时均诱导氧化应激，但6PPD似乎比6PPD-Q更具毒性。

6PPD和6PPD-Q诱导酿酒酵母线粒体功能障碍的毒性机制研究解读

**研究背景**

6PPD（N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-对苯二胺）是20世纪60年代开发的一种轮胎抗臭氧剂，用于防止橡胶在臭氧存在下的氧化降解。当6PPD与臭氧反应时，会生成其主要转化产物6PPD-醌（6PPD-Q）。6PPD和6PPD-Q可通过轮胎磨损颗粒（TWPs）进入环境，在雨水路面径流中被广泛检出，已成为城市流域环境安全的重大关注点。2021年，6PPD-Q被确定为导致美国太平洋西北地区银鲑（Oncorhynchus kisutch）急性死亡的原因，该现象被称为城市径流死亡综合征（URMS）。常见环境浓度为0.1至10 μg/L，而银鲑的半数致死浓度（LC₅₀）仅为0.8 μg/L，这引发了全球范围内的监管关注。目前，美国、加拿大和欧盟等正在起草针对PPDs的法规，但对6PPD和6PPD-Q毒性机制的了解仍存在大量空白。尤其值得注意的是，尚无研究探讨PPDs对单细胞真核生物的毒性效应。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在环境中广泛存在，与植物和土壤密切相关，且具有全基因组序列和高度保守的DNA区域，是环境与人类健康研究的理想模式生物。因此，本研究选用酿酒酵母作为模型生物，旨在阐明6PPD和6PPD-Q的毒性效应及其分子机制，为环境法规制定提供科学依据。该项研究成果发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

**研究内容与关键方法**

研究人员采用多种实验技术开展研究。首先，使用生长测定（growth assay）评估6PPD和6PPD-Q对酵母增殖的影响，并计算半数抑制浓度（IC₅₀）。其次，利用动态光散射（DLS）和Zeta电位分析检测两种化合物在不同pH值和培养基中的聚集行为与表面电荷。第三，通过RNA测序（RNA-seq）分析差异表达基因（DEGs），并使用Panther Gene Ontology（GO）进行功能分类，使用KEGG通路分析富集通路。第四，采用Mito Tracker Red染色结合共聚焦显微镜评估线粒体膜电位变化。最后，通过RT-qPCR对RNA-seq结果进行验证。所用酵母菌株为S288c（表达Abp1-GFP标记蛋白），化学处理浓度分别为56 μM 6PPD和50 μM 6PPD-Q。RNA-seq样本送至Novogene公司进行测序分析。

**研究结果**

**2.1 酵母生长测定**：生长测定结果显示，6PPD处理导致酵母活力呈剂量依赖性下降，计算得IC₅₀为56 μM。1.8% DMSO对照实验确认溶剂对活力下降无影响。相比之下，6PPD-Q仅在最高浓度（100和50 μM）时引起酵母活力轻微下降。动力学生长曲线显示，6PPD处理组在5小时后出现生长延迟，但24小时内除200 μM组外，各组均恢复至对数生长期，表明6PPD的生长抑制作用在一定浓度下是可逆的。

**2.2 6PPD和6PPD-Q在培养基中的聚集**：DLS分析表明，在pH 5时6PPD（611.9 ± 24.25 nm）和6PPD-Q（1335 ± 338.4 nm）的水合直径最大，而在其他pH值下两种化合物的平均直径保持在250至400 nm范围内。在YPD培养基中，6PPD-Q的Zeta电位为?13.2 mV，较6PPD（?8.33 mV）更负，这可能与6PPD-Q的醌官能团或胺官能团与YPD中游离离子的相互作用有关。6PPD-Q在SD和YPD培养基中均表现出显著聚集，且具有较高的背景吸光度，研究人员在生长测定数据处理中对此进行了背景扣除校正。

**2.3 RNA测序分析**：RNA-seq结果显示，6PPD处理导致596个基因上调和436个基因下调；6PPD-Q处理导致425个基因上调和360个基因下调。GO分析显示，6PPD上调基因富集于氧化还原酶、DNA结合转录因子、锌指转录因子等蛋白类别，下调基因富集于转运蛋白、ATP合酶、脱氢酶等类别；6PPD-Q上调基因富集于氧化还原酶和非受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，下调基因富集于翻译蛋白类别。两种处理均下调了线粒体基因QCR10（编码细胞色素bc1复合物亚基），同时上调了MPC3（丙酮酸转运蛋白）和HXT6（己糖转运蛋白），提示细胞应激反应。此外，两种PPDs的机制似乎存在差异，6PPD下调但6PPD-Q上调的基因有57个，如NDI1（复合物I亚基）和RAD59（双链断裂DNA修复基因）。

**2.4 KEGG通路分析**：
**2.4.1 6PPD和6PPD-Q下调氧化磷酸化KEGG通路基因**：6PPD处理下调了31个氧化磷酸化通路基因，包括2个线粒体基质基因（NDI1、PPA2）、1个辅酶Q基因（PET100）、10个复合物III基因（COB、COR1、CYT1、QCR2、QCR6、QCR7、QCR8、QCR9、QCR10、RIP1）、12个复合物IV基因（COX1、COX2、COX3、COX4、COX5A、COX5B、COX6、COX7、COX8、COX9、COX12、COX13）和6个复合物V（ATP合酶）基因（ATP2、ATP3、ATP4、ATP5、ATP19、ATP20）。6PPD-Q处理下调了9个相关基因，包括ACP1、PET100、QCR7、QCR9、QCR10、COX9、COX13、ATP19和ATP20。
**2.4.2 6PPD上调精氨酸生物合成KEGG通路基因**：6PPD处理上调了5个精氨酸生物合成通路基因（GDH1、GLN1、ARG3、ARG1、CAR1）。值得注意的是，ARG1和ARG3同时被6PPD-Q下调。精氨酸及其中间产物在应激条件下可作为活性氧（ROS）清除剂、一氧化氮前体和多胺前体，其失调具有重要生物学意义。
**2.4.3 6PPD-Q上调半胱氨酸和甲硫氨酸生物合成KEGG通路基因**：6PPD-Q处理上调了10个直接参与半胱氨酸和甲硫氨酸生物合成通路的基因（MET1、MET2、MET3、MET5、MET6、MET8、MET10、MET14、MET28、STR3）和6个相关基因（ADI1、ARO9、CYS3、MET13、MET30、MHT1），该通路同样参与细胞应激反应。

**2.5 线粒体染色**：Mito Tracker Red染色显示，56 μM 6PPD处理6小时后，线粒体荧光强度显著低于未处理组（n = 27，p < 0.0001），表明线粒体膜电位下降，能量代谢降低，与生长抑制结果一致。6PPD-Q的染色实验因聚集影响染料进入细胞而未获得成功结果。

**2.6 RT-qPCR分析**：以ACT1（肌动蛋白）为内参基因，6PPD处理组中ADF1（转录抑制因子）相对表达量升至5.211 ± 1.162，STR3（胱硫醚β-裂解酶）降至0.1277 ± 0.2113；6PPD-Q处理组中SUL1（高亲和力硫酸盐转运蛋白）升至2.961 ± 0.2938，COS4（内体蛋白）降至0.2980 ± 0.1045。RT-qPCR结果验证了RNA-seq数据的可靠性。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究表明6PPD和6PPD-Q通过下调氧化磷酸化通路基因导致线粒体功能障碍，该发现与秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的研究结果一致，提示PPDs在不同物种间可能存在相似的作用机制。两者均诱导酵母应激反应，涉及DNA修复（RAD59）、氧化应激抗性（QCR7）、渗透应激（HXT11）和营养饥饿应激（ARG3、MET1）等多个通路。6PPD的毒性强于6PPD-Q，可能归因于6PPD-Q在YPD培养基中的聚集降低了细胞摄取，6PPD-Q的负Zeta电位（?13.2 mV）与酵母表面负电荷产生的静电排斥也可能贡献于此。此外，6PPD可能在酵母体内被代谢为6PPD-Q或其他毒性转化产物，这有待通过质谱代谢组学进一步验证。

研究结论表明，6PPD抑制酵母增殖并使大量氧化磷酸化基因和应激反应相关基因失调；6PPD-Q虽然表现出一定的生长促进作用假象，但在校正背景吸光度后同样影响氧化磷酸化基因和应激反应基因。该工作首次揭示了6PPD和6PPD-Q在生长培养基中的聚集现象及其对酿酒酵母代谢和氧化磷酸化通路基因调控的广泛影响，为理解PPDs对单细胞真核生物的毒性机制提供了新的见解，也为未来环境健康风险评估和法规制定提供了重要科学依据。