《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Wide Analysis of the PYL Gene Family and Its Expression Dynamics in Response to Abscisic Acid in Tomato
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植物激素脱落酸（abscisic acid，ABA）在植物整个生命周期及环境胁迫适应性响应中发挥关键作用。Pyrabactin抗性1类似蛋白（PYR/PYL/RCAR）作为ABA的直接受体，是ABA信号转导通路中的关键调控因子。尽管PYL基因已在多种植物中被鉴
植物激素脱落酸（abscisic acid，ABA）在植物整个生命周期及环境胁迫适应性响应中发挥关键作用。Pyrabactin抗性1类似蛋白（PYR/PYL/RCAR）作为ABA的直接受体，是ABA信号转导通路中的关键调控因子。尽管PYL基因已在多种植物中被鉴定，但其在番茄（Solanum lycopersicum）中的进化与结构特征仍不明确。为填补这一空白，研究人员鉴定出9个SlPYL基因，并将其划分为三个亚家族：I族（2个基因）、II族（3个基因）和III族（4个基因），其编码蛋白被预测主要定位于细胞质和叶绿体中。结构分析揭示了多样的外显子-内含子组织及5个保守基序。所有鉴定的SlPYL均含有START结构域（PF10604），证实其作为真实PYL蛋白的身份。SlPYL启动子区域的顺式作用调控元件预测显示其与光响应、激素信号、胁迫响应以及植物生长发育相关。翻译后修饰位点预测表明，SlPYL主要分别在丝氨酸和赖氨酸残基上发生磷酸化和乙酰化修饰。三级结构建模证明SlPYL蛋白具有保守的三维构象，支持其功能保守性。表达谱分析显示，特定SlPYL基因在ABA处理后于不同组织（根、叶、芽）中呈现差异表达模式，表明其功能已发生分化。鉴于ABA积累与芽萌发之间已确立的负相关关系，部分SlPYL基因（SlPYL3、SlPYL4、SlPYL7和SlPYL8）在ABA诱导下的差异表达（3~5倍），特别是在处理后24小时（24 hpt）的芽组织中，提示其在ABA介导的芽萌发抑制中具有潜在作用。然而，这些功能推断主要基于全基因组计算分析和表达谱分析，仍需进一步的实验验证。
**番茄SlPYL基因家族的全基因组鉴定与ABA响应表达分析研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
脱落酸（abscisic acid，ABA）是植物体内一种至关重要的倍半萜类植物激素，在植物种子休眠与萌发、幼苗生长发育、气孔运动调节以及响应干旱、高盐、低温等非生物胁迫过程中均发挥核心调控作用。近年来研究进一步表明，ABA信号通路与活性氧（reactive oxygen species，ROS）稳态及抗氧化防御体系存在密切的交互调控网络，共同介导植物的环境适应性。在ABA信号感知与转导过程中，pyrabactin抗性1类似蛋白（PYR/PYL/RCAR，简称PYL）作为ABA的胞内可溶性受体，构成了信号通路的起始感知模块。在低ABA水平下，蛋白磷酸酶2C（protein phosphatase 2C，PP2C）与SNF1相关蛋白激酶2（SNF1-related protein kinase 2，SnRK2）结合并磷酸化抑制后者活性，使信号通路处于关闭状态；当ABA水平升高时，ABA与PYL受体结合后发生构象变化，进而抑制PP2C活性，解除其对SnRK2的抑制，启动下游磷酸化级联反应，最终激活ABA响应基因的表达。PYL基因家族已在拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、短柄草、油菜和大豆等多种植物中完成了全基因组鉴定，其家族成员数量在不同物种间差异显著。然而在番茄中，尽管前期已有部分关于SlPYL基因参与非生物胁迫响应的报道，但针对全家族的系统性进化分析、结构特征解析及其在植株构型调控中潜在功能的研究仍较为有限，特别是在芽发育和分枝调控层面存在明显的知识空白。同时，ABA已被证实可负向调控侧芽萌发并维持芽休眠状态，暗示ABA信号组分可能在塑造植物构型中发挥重要作用。因此，系统地鉴定番茄PYL基因家族成员并解析其响应ABA的表达特征，对深入理解ABA介导的番茄生长发育调控机制具有重要的科学意义和应用价值。
**二、研究人员开展的研究工作与主要结论**
针对上述科学问题，研究人员以番茄品种“Alisa Craig”为研究对象，利用拟南芥13个已知PYL蛋白序列作为查询序列，通过BLASTP搜索番茄基因组组装版本SL4.0，在全基因组水平上系统鉴定了番茄PYL基因家族成员，并综合运用生物信息学与分子生物学手段对其进行了表征。研究最终在番茄基因组中鉴定出9个SlPYL基因，命名为SlPYL1至SlPYL9。系统进化分析将这9个成员划分为三个亚家族：I族包含SlPYL8和SlPYL9，II族包含SlPYL1、SlPYL2和SlPYL3，III族包含SlPYL4、SlPYL5、SlPYL6和SlPYL7。所有SlPYL蛋白均含有保守的START结构域（PF10604）和特征性的SGLP门控基序，验证了其作为功能ABA受体的分子身份。该基因家族在番茄基因组中分布于第02至12号染色体上，其中第06号染色体上分布有3个家族成员（SlPYL1、SlPYL4和SlPYL9），提示该区域可能存在局部基因复制或保留事件。蛋白质理化性质预测表明，SlPYL蛋白全长范围为190至322个氨基酸，理论等电点介于5.03至6.65之间；亚细胞定位预测提示其主要定位于细胞质和叶绿体中。基因结构分析显示，多数SlPYL基因结构较为简单，其中SlPYL8、SlPYL3和SlPYL4各含一个内含子，其余成员为无内含子基因，暗示该家族在进化过程中经历了结构分化。启动子顺式作用元件分析揭示SlPYL基因启动子区域内富含光响应元件、激素响应元件及胁迫响应元件，其中ABA响应元件（ABRE）和STRE元件尤为丰富。翻译后修饰位点预测结果表明，SlPYL蛋白以丝氨酸残基磷酸化和赖氨酸残基乙酰化为主要修饰形式，同时存在糖基化、泛素化等位点。蛋白质三级结构建模显示，所有SlPYL蛋白均具有典型的PYL家族α-螺旋和β-折叠交替排列的保守三维折叠构象。
在表达特征分析方面，研究人员采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测了SlPYL基因在番茄根、叶、芽三种组织中的表达水平及外源ABA处理后的时间动态响应。结果表明，多数SlPYL基因在叶片中表现出较高表达水平；芽组织中SlPYL3、SlPYL4、SlPYL6和SlPYL7的表达相对较高，其中SlPYL3表达最为突出。外源ABA处理后，大部分SlPYL基因在叶片组织中出现显著的诱导表达，其中SlPYL3和SlPYL7在处理后24小时分别上调约5倍和5.5倍；在芽组织中，SlPYL3和SlPYL7亦呈现显著的ABA诱导表达，表达量分别约为3~6倍和2.5~4.5倍，且表达水平随时间呈递增趋势。值得注意的是，ABA在维持芽休眠和抑制芽萌发中的抑制性作用已被广泛认可，而SlPYL3、SlPYL4、SlPYL7和SlPYL8在芽组织中响应ABA的差异表达（3~5倍）为其参与ABA介导的芽萌发抑制过程提供了间接的分子证据。该研究结果系统揭示了SlPYL基因家族的进化特征和表达分化格局，为深入解析ABA受体基因在调控番茄植株构型中的潜在功能提供了重要的候选基因资源和理论依据。然而，上述功能推断主要来源于全基因组计算分析和表达谱分析，后续仍需借助遗传突变体和转基因手段进行实验验证。该研究成果发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
**三、主要研究关键技术方法**
该研究首先利用BLASTP同源搜索在番茄基因组（SL4.0）中鉴定SlPYL基因家族成员。随后采用MEGA X软件最大似然法（1000次bootstrap重复）构建拟南芥、油菜和番茄PYL蛋白的系统发育树；使用NCBI保守结构域数据库（CDD）和MEME Suite分别鉴定保守结构域和保守基序；通过Gene Structure Display Server（GSDS）解析基因外显子-内含子结构；利用PlantCARE数据库进行启动子顺式作用元件预测；使用Phyre2服务器进行蛋白质三级结构同源建模；通过MusiteDeep工具预测翻译后修饰（PTM）位点；蛋白质亚细胞定位预测采用DeepLoc 2.0。表达分析方面，研究人员以番茄品种“Alisa Craig”为材料，对约三周龄幼苗喷施50 μM ABA溶液，以蒸馏水处理作为对照，分别于处理后6小时、12小时和24小时采集根、叶、芽组织样本，每个样本取自9株独立植株的混合样品；采用TRIzol法提取总RNA，以SYBR Green染料法进行qRT-PCR检测，以SlActin（Solyc03g078400）为内参基因，使用2
?ΔΔCt法计算相对表达量，并以Student’s t检验进行统计学差异分析。
**四、研究结果分述**
**（一）番茄PYL基因家族成员的鉴定与理化性质分析**
通过BLASTP搜索，研究人员从番茄基因组中鉴定出9个编码PYL蛋白的基因，命名为SlPYL1至SlPYL9。蛋白质长度范围为190至322个氨基酸；理论等电点范围为5.03至6.65；预测所有SlPYL蛋白均含START结构域（PF10604）和SGLP门控基序，确认为ABA受体家族成员。染色体定位分析显示该基因家族分布于第02、06、08、09、10、12号染色体上，其中第06号染色体包含3个成员，为家族成员分布最多的染色体，提示可能的基因复制或保留事件。
**（二）系统进化与亚家族分类分析**
基于最大似然法构建的拟南芥（13个）、油菜（25个）与番茄（9个）PYL蛋白系统发育树将全部成员划分为三大进化支（I、II、III），该分类与已报道的其他物种PYL蛋白分类方式一致。番茄SlPYL蛋白与拟南芥和油菜的同源蛋白聚集紧密，表明PYL家族在双子叶植物中具有高度的进化保守性。值得注意的是，拟南芥AtPYL12所在分支未检测到油菜和番茄直系同源基因，提示该基因可能在进化过程中发生了丢失或功能分化。
**（三）保守结构域、基序与基因结构分析**
结构域分析确认所有SlPYL蛋白均含有保守的START结构域（PF10604）。MEME基序分析共鉴定出5个保守基序，长度为21~50个氨基酸不等。亚家族内部的基序组成高度一致：I族成员含3个基序，II族成员含4个基序（1、2、3、5），III族成员含4个基序（1、2、3、4）。其中基序2在所有SlPYL蛋白中均存在，即特征性的SGLP门控基序，是ABA结合和受体活性所必需的关键序列。基因结构分析显示，SlPYL8、SlPYL3和SlPYL4各有一个内含子，其余基因均为无内含子结构，反映亚家族间存在结构多样性。
**（四）启动子顺式作用元件分析**
对SlPYL基因起始密码子上游2 kb启动子区域的顺式作用元件（cis-acting regulatory element，CRE）预测发现，这些启动子富含与光响应（MRE、Box 4、AE-box、GAP-box、ACE、GATA-motif）、植物激素信号（ABRE、ARE、ERE、TCA-element、CGTCA-motif、TGACG-motif）、胁迫响应（MBS、LTR、GT1-motif、STRE、TC-rich repeats、W-box）以及生长发育调控相关的多种调控元件。其中Box 4最为丰富（42个），SlPYL8含有最多ABRE元件（5个）。此外，SlPYL3启动子区域含有TCCGAGC基序，该基序是PAT1转录因子的潜在结合位点，提示PAT1可能参与SlPYL3的转录调控。
**（五）蛋白质三级结构建模与结构特征分析**
利用Phyre2服务器同源建模获得所有SlPYL蛋白的三维结构模型，建模置信度均达到99.9%~100%。二级结构预测显示SlPYL蛋白以α-螺旋和β-折叠为主要结构元件。三级结构建模表明所有SlPYL蛋白均呈现PYL家族典型的保守折叠模式，即由α-螺旋和β-折叠交替排列构成疏水性ABA结合口袋，支撑了其在ABA感知中的共同功能。
**（六）翻译后修饰位点预测**
MusiteDeep预测结果显示，磷酸化是SlPYL蛋白中最丰富的翻译后修饰类型，以丝氨酸残基磷酸化为主，所有SlPYL蛋白均含有至少一个潜在的丝氨酸磷酸化位点，其中SlPYL2含有最多（7个）。此外，多个SlPYL蛋白预测存在赖氨酸残基乙酰化和泛素化位点；少数成员预测存在半胱氨酸棕榈酰化、脯氨酸羟基化和精氨酸甲基化位点。这些结果提示SlPYL蛋白可能受多层翻译后调控。
**（七）SlPYL基因组织特异性表达及ABA响应表达谱分析**
qRT-PCR结果显示，多数SlPYL基因（SlPYL2~SlPYL8）在根、叶、芽中均检测到表达信号。SlPYL4、SlPYL5、SlPYL6和SlPYL7在根中表达相对较高（约2~3倍富集）；叶片中除SlPYL1外，多数家族成员呈较高表达水平；芽组织中SlPYL3、SlPYL4、SlPYL6和SlPYL7表达较突出，其中SlPYL3表达量最高。外源ABA处理在根、叶、芽三种组织中均显著诱导多数SlPYL基因的表达，叶片组织的诱导幅度整体高于根组织。SlPYL3和SlPYL7在叶片中于24 hpt时分别上调约5倍和5.5倍；在芽组织中，SlPYL3和SlPYL7的诱导范围分别为3~6倍和2.5~4.5倍，且呈时间依赖性递增。该表达上调模式与SlPYL基因启动子中ABRE元件的富集相互印证，支持其转录水平受ABA信号直接调控。
**五、讨论与结论总结**
在讨论部分，研究人员指出本研究通过整合全基因组鉴定、进化分析、蛋白结构解析、启动子元件和翻译后修饰位点预测以及多组织ABA响应表达谱分析，系统揭示了番茄SlPYL基因家族的分子特征。SlPYL蛋白中START结构域和SGLP门控基序的保守性表明其具备基本ABA结合能力的结构基础。启动子中ABA响应元件（ABRE）的富集与ABA处理下多个SlPYL基因的转录诱导相互印证，证实该家族成员参与ABA信号的转录调控网络。此外，与ABA抑制芽萌发的已知功能相关联，SlPYL3和SlPYL7在芽组织中对ABA处理的持续和增强响应，提示特定SlPYL成员可能参与ABA介导的芽发育及植株构型的调控。研究人员同时强调，此类功能推断主要基于计算分析和表达谱数据，仍需通过遗传学和生化实验验证其确切的生物学功能。
结论部分综合表述为：本研究通过全基因组分析在番茄中鉴定出9个SlPYL基因，系统进化上划分为三个亚家族，所有成员均具有保守的START结构域及特征性基序，提示其作为ABA受体的功能保守性。启动子区域中包含多种顺式作用调控元件，特别是ABA响应元件（ABRE），表明SlPYL基因受激素和环境信号的转录调控。翻译后修饰位点预测结果显示SlPYL蛋白存在多层翻译后调控潜能，但需实验证实。外源ABA处理显著诱导多个SlPYL基因的表达，其中SlPYL3在芽组织中呈现显著且持续的诱导表达，SlPYL3、-4、-5、-6、-7和-8在叶片中亦显著上调。鉴于ABA在抑制芽萌发中的已知作用，SlPYL基因在芽组织中的ABA诱导表达模式提示其可能参与ABA介导的芽萌发抑制及植株构型调控，上述推断仍有待功能实验验证。
