一种靶向流感病毒血凝素（Hemagglutinin, HA）–α-2,6-唾液酸相互作用抑制剂的新型基于细胞的高通量筛选模型

《Biomolecules》：A Novel Cell-Based High-Throughput Screening Model for Inhibitors Targeting Influenza Virus Hemagglutinin–α-2,6-Sialic Acid Interaction

　　

日益加剧的耐药性问题削弱了当前抗流感病毒疗法的疗效。尽管靶向血凝素（HA）–唾液酸受体相互作用是一项颇具前景的策略，但缺乏亚型非依赖性的筛选模型阻碍了进展。为此，研究人员建立了一种基于荧光信号的细胞高通量模型，采用异硫氰酸荧光素偶联的西洋接骨木凝集素（FITC-SNA）作为稳定的HA替代物，并选用过表达α-2,6-唾液基转移酶（ST6GAL1）的MDCK细胞来模拟HA–受体界面。该平台旨在作为一种高效的初筛工具，快速从大型化合物库中过滤出潜在结合受体结合界面的分子。对10,000个化合物的筛选鉴定出甲磺酸盐奥巴克拉克斯（Obatoclax Mesylate）和乙基对羟基苯甲酸酯（Ethylparaben）为初步命中化合物。两者均表现出广谱HA抑制活性，验证了该模型识别干扰病毒附着分子的能力。进一步的细胞抗病毒实验显示两化合物均具细胞毒性，选择指数（SI）偏低，表明尽管这些分子有效靶向相互作用位点，但仍需大量结构优化才能用于治疗。分子对接确认其结合A型H1N1、H3N2及B/Victoria HA蛋白，而ADMET预测突出了缓解毒性所需的具体结构优化方向。综上，这种亚型非依赖、高特异性的高通量筛选（HTS）模型为流感药物发现早期阶段及先导化合物开发提供了高效可靠平台。

研究背景与立项依据：流感病毒每年致全球5%–15%人口感染，约29万–65万呼吸道死亡，疫苗因抗原漂变/转变需年更且保护率10%–60%，主流靶向神经氨酸酶或M2离子通道药物耐药普遍，聚合酶抑制剂亦现耐药风险。病毒HA与宿主受体结合是入侵前提，破坏该互作可双重预防与治疗，但现有活病毒/假病毒进入实验耗时长、需BSL-2/3；血凝抑制（HAI）等低通量半定量；噬菌体展示得抗体非小分子；宿主糖基工程改受体非直接平台。因此亟需稳健、高通量、亚型非依赖的直接评估HA–受体结合抑制模型。研究人员据此开展本研究，建立以FITC-SNA为功能替代探针、ST6GAL1过表达MDCK细胞为载体、检测RFU下降的荧光细胞HTS，筛10,000化合物得两命中，经HAI、CPE、分子对接、ADMET多层验证，证模型可行，结论指两命中具广谱附着抑制但毒性大需优化，模型为无活病毒早筛提供工具，文发于《Biomolecules》。

主要关键技术方法：构建ST6GAL1慢病毒转导MDCK稳转细胞系（流式分选单克隆，RT-qPCR/Western blot验证）；以FITC-SNA浓度、温度、时间、DMSO耐受、洗板次数系统优化读数，用6′-唾液乳糖（6′-SL）与小麦胚凝集素（WGA）做阳性、3′-SL做特异性对照、神经氨酸酶预处理做消解对照，算Z′因子评质量；自中国医学科学院药物研究所提供的10,000个类药小分子库（TargetMol/Selleck源，10 mM DMSO储液）初筛50 μM、次筛定IC₅₀；CCK-8测CC₅₀；HAI用A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)、A/Aichi/2/1968(X31)(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(B/Victoria)、B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata)鸡胚毒种与豚鼠红细胞；CPE法MDCK感染MOI=0.1测EC₅₀算SI；MOE 2024对PDB 9N8P/3ZTJ/4FQM做Site Finder对接；ADMETlab 3.0/SwissADME预测。

研究结果

3.1 细胞HTS模型建立与可行性：稳转ST6GAL1-MDCK的RFU约为野生型2倍，神经氨酸酶预处理显著降荧光，无探针自荧光可忽略，证受体上调与探针特异。

3.2 模型系统优化：FITC-SNA在20–40 μg/mL饱和选20 μg/mL；25 °C与37 °C信号无差选25 °C；60 min达平衡选60 min；DMSO≤2%不影响、5%–10%抑信号，限≤2%；洗1–3次无差选1次。最优条件：20 μg/mL、25 °C、60 min、≤2% DMSO、1次PBS洗。

3.3 验证与可靠性：6′-SL剂量依赖抑RFU（IC₅₀=16.86±1.36 μM），WGA弱结合不定IC₅₀；200 μM 6′-SL显抑、200 μM 3′-SL几乎无抑，证α-2,6特异；Z′=0.75（≥0.5合格）。

3.4 命中筛选与毒性：10,000化合物初筛（50 μM，抑≥50%）得5初命，复筛确两命：Obatoclax Mesylate（IC₅₀=16.86±1.36 μM）、Ethylparaben（IC₅₀=33.46±3.27 μM）；48 h CC₅₀分别为224.5±0.46 nM与23.55±0.31 μM，但筛窗2 h 50 μM时存活>90%排急性假阳。

3.5 HAI实验：Obatoclax Mesylate非溶血浓度（<25 μM）下对H1N1沉淀抑聚（12.5–3.12 μM），对B/Victoria、B/Yamagata亦阻凝；Ethylparaben对H1N1、H3N2、B/Victoria、B/Yamagata均呈浓度依赖沉淀（抑凝集），证广谱附着阻断。

3.6 CPE抑制：Obatoclax因高毒无法评；Ethylparaben EC₅₀为H1N1 103.00±0.80 μM、H3N2 50.69±9.10 μM、B/Victoria 35.50±0.77 μM、B/Yamagata 41.37±10.00 μM，SI<1，表有效浓度与毒浓重叠窄窗。

3.7 分子对接：9N8P中Obatoclax得分?6.03（氢键ARG²¹¹、π-H堆叠PHE²¹³/ARG²¹¹/TYR²³³，涉220-loop ARG²¹¹/ARG²¹²/PHE²¹³）；Ethylparaben?4.86（氢键LYS⁵⁷²）。3ZTJ中Obatoclax?5.34（氢键SER²⁶⁵）、Ethylparaben?5.24（氢键GLU⁶¹/GLN⁶⁵，周边非经典RBS）。4FQM中Obatoclax?6.95（π-H VAL²⁴⁹）、Ethylparaben?5.29（氢键ASN²¹⁵）。结合位部分叠于经典RBS，靠空间位阻阻唾液酸入位。

3.8 ADMET预测：Obatoclax分子量/logP合口服标准、合成易、hERG低、BBB低渗，但透膜差、血浆蛋白结合（PPB）极高、抑CYP1A2/CYP3A4、毒高、清除低；Ethylparaben理化合规则（Lipinski/Pfizer/GSK）、合成易，但人肠吸收（HIA）差、Caco-2/MDCK中透、CYP1A2/CYP2C19强抑、CYP2C9底物、眼刺激高、雌激素活性显。

讨论浓缩：靶向HA–受体互作抗耐药有据，但活病毒平台瓶颈大；以SNA替HA使亚型非依赖，代价是可能命中也靶受体/探针/荧光团，故模型定位初筛漏斗首层，需HAI/CPE/对接/ADMET逐级排假阳；因SNA与HA无同源性，仅靶病毒独有口袋者可能漏检，但刻意偏保守受体界面利于广谱。相较HAb2等表达特异HA细胞系，本模型免活毒、免多株维护；相较SPR/BLI通量低、失膜环境，本模型留原生膜与多价性，用酶标仪平衡效率成本。两命中HAI真抑病毒附着，CC₅₀与EC₅₀近致SI<1，作工具化合物证模型可用，需保HA结合骨架剔毒基；Ethylparaben在CPE效弱于HAI暗示脱靶/胞内扰。局限为不覆盖α-2,3（禽流感受体），可共表达α-2,3-唾液基转移酶与MAL-II扩面；酶标仪选型为通量弃流式（建系分选用流式），Z′=0.75已足。

结论翻译：本研究建立并验证一种依赖荧光的基于细胞的高通量筛选（HTS）模型，靶向流感病毒HA–α-2,6-唾液酸受体互作。以FITC-SNA为亚型非依赖替代探针、ST6GAL1过表达MDCK细胞为载体，优化后模型具优异特异与可靠度，满HTS标准。筛10,000化合物得两命：Obatoclax Mesylate与Ethylparaben，证模型能检HA–受体互作抑制剂。虽两命具广谱HAI活性，但后续表征显显著细胞毒与低选择指数，不能直接临床。分子对接与ADMET给活性结构基并指明降毒优化向。研究示靶向保守受体界面为可行广谱策略，但须精细优化分离抗病毒效与宿主毒。所建亚型非依赖平台为无病毒早筛工具，并为未来更安全有效抗病毒发现打灵活基，有望借脱钩初筛与特异亚型约束加速大流行潜力株应对。